A Bioensaio simples para a avaliação dos fatores de crescimento endotelial vascular
Summary
Descreve-se um bioensaio baseado em células simples para a detecção, quantificação e a monitorização da actividade de membros da família de ligandos vasculares factor de crescimento endotelial. O ensaio utiliza receptores quiméricos expressos numa linha celular dependente de factores para proporcionar uma avaliação semi-quantitativa ou quantitativa de ligação ao receptor e a reticulação pelo ligando.
Abstract
A análise de tirosina-quinases de receptor e seus ligandos que interagem envolvidas na biologia vascular é muitas vezes difícil devido à expressão constitutiva de famílias dos receptores relacionados, uma ampla gama de ligantes relacionados, e a dificuldade de lidar com as culturas primárias de células endoteliais especializadas. Descrevemos aqui um bioensaio para a detecção de ligandos para o factor de crescimento endotelial vascular receptor-2 (VEGFR-2), um transdutor chave de sinais que promovem a angiogénese e linf angiogénese. Um ADNc que codifica uma fusão da região extracelular (de ligação ao ligando) do VEGFR-2 com as regiões transmembrana e citoplasmático do receptor de eritropoietina (EpoR) é expressa na linha celular dependente de factor de Ba / F3. Esta linha de células cresce na presença de interleucina-3 (IL-3) e retirada deste factor resulta na morte das células dentro de 24 horas. A expressão da fusão do receptor VEGFR-2 / EpoR fornece um mecanismo alternativo para promover a sobrevivência e potencially proliferação de células Ba / F3 estavelmente transfectadas na presença de um ligando capaz de se ligar e de reticulação a porção extracelular da proteína de fusão (ou seja, um que pode cruzar-ligação VEGFR-2 a região extracelular). O ensaio pode ser realizado de duas formas: uma abordagem semi-quantitativa, em que pequenos volumes de ligando e células permitir um resultado rápido, em 24 h, e uma abordagem quantitativa envolvendo marcadores substitutos de um número de células viáveis. O ensaio é relativamente fácil de realizar, é altamente sensível às conhecidas VEGFR-2 e ligandos podem acomodar inibidores extracelulares do VEGFR-2 de sinalização, tais como anticorpos monoclonais para o receptor ou ligandos, e armadilhas ligando solúvel.
Introduction
A família do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) de factores de crescimento de proteínas secretadas e dos seus receptores de superfície celular cognato é um grupo importante e diverso de ligandos e receptores solúveis incorporados à membrana, respectivamente, que em função de transdução de sinais através das membranas celulares. Eles funcionam principalmente em células endoteliais mas também em células de origem epitelial e as do sistema imunológico 1,2. Vias de sinalização envolvidas por receptores activados por ligandos VEGF (VEGFR) são críticos em grandes patologias, tais como a degeneração macular relacionada com a idade e cancro e terapêutica de segmentação eles estão em uso clínico frequente (por exemplo, o bevacizumab, anticorpo monoclonal que tem como alvo VEGF-A) 3,4.
Uma das complexidades da família VEGF é a diversidade de ligandos solúveis presentes na natureza (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, as proteínas VEGF codificadas pela ORF parapox vírus da família e de veneno de cobra de VEGF, além de outros inibitórioisoformas de VEGF-A) 2.
Estes ligandos interagem com os três membros da família do receptor de tirosina-quinase, nomeadamente VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. Estes receptores são variavelmente expressa em diferentes tipos de células, mas são muitas vezes co-expressos na superfície das células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos e linfáticos de todos os tamanhos 5. VEGFR-2 podem ligar-se a mamíferos ligandos VEGF-A 6, VEGF-C e VEGF-7 D 8,9, bem como vírus da ORF de VEGF 10 e 11 de veneno de cobra de VEGF. VEGFR-2 desempenha um papel importante na condução da angiogénese (a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes) no desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, cancro e doenças dos olhos. Nestes contextos, os ligandos, tais como VEGF-A, -C e -D ligam-se e activam o receptor de sangue em células endoteliais vasculares 12-15. Em células endoteliais linfáticas, VEGFR-2 desempenha um papel na linf angiogénese, a formação de novos vasos linfáticos 16. VEGFR-2 também pode promover dilatação e expansão das grandes artérias e vasos linfáticos em tecidos saudáveis e doenças 17. Uma compreensão completa do VEGFR-2: ligante é, por conseguinte, importante para o desenvolvimento de inibidores para utilização no tratamento de doenças dependentes de angiogénese 18. Enquanto a maioria das isoformas do VEGF-A se ligam ao VEGFR-2, a clivagem proteolítica de VEGF-C e VEGF-D é necessária para libertar um fragmento que consiste no domínio de homologia de VEGF-que exibe ligação para o VEGFR-2 de elevada afinidade 19,20.
Nós desenvolvemos um ensaio biológico para monitorar ligantes de VEGFR-2, que é projetado para contornar a necessidade de células primárias endoteliais, que são tecnicamente difíceis de passagem, caro para comprar e cultura (o que exige especializados de média) 21 e expressar múltiplos VEGFRs e associado co- receptores 22. Heterodimerização de VEGFR-2 com outros receptores VEGF ou co-receptores podem causar complexidade indesejada quando com o objetivo de parafuso prisioneiroy interacções receptor-ligando binários, avaliando a actividade atribuível a um receptor específico, ou avaliar o efeito dos reagentes de inibidores. 23. O bioensaio mantém a mobilidade do receptor relevante na membrana da célula e permite a avaliação da capacidade de um ligando para se ligar e reticular o VEGFR-2 região extracelular.
O bioensaio baseia-se na criação de um receptor quimérico em que a região extracelular de um receptor de VEGF (neste caso, o VEGFR-2) é fundida com as regiões transmembrana e intracelular do receptor de eritropoietina (EpoR), um membro da família do receptor de citocina 8,24. Esta proteína de fusão é então expressa na linha de células pró-B dependentes de factor de Ba / F3, em que a estimulação com um ligando capaz de se ligar e de ligação cruzada do domínio extracelular do receptor provoca a activação da região efectora citoplasmático, que é capaz de transduzir um sinal de sobrevivência através de Janus quinases (JAK) para promover a célulaa sobrevivência e / ou proliferação. Em contraste, a expressão de comprimento completo de VEGFR-2 no mesmo tipo de célula, e a estimulação com o ligando, não promover a sobrevivência e proliferação das células, indicando que os efectores de sinalização proximal da via o VEGFR-2 não estão disponíveis para este tipo de células.
Temos usado o ensaio em uma variedade de contextos para explorar ligação de novos VEGFR-2 ligantes 10,19,20,24-29. Em combinação com um ensaio / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, que compararam as actividades relativas de VEGF-C e os factores de crescimento VEGF-D para a ligação e ligação cruzada do VEGFR-2 e VEGFR-3 30. O ensaio tem sido utilizado para caracterizar a actividade inibidora dos anticorpos monoclonais neutralizantes para o VEGFR-2 ou VEGF-D, VEGFR-2 solúvel armadilha e peptidomiméticos de segmentação da família VEGF 31. O ensaio também foi utilizado para mostrar a capacidade de VEGF a partir de diferentes estirpes de vírus ORF para ligar e reticular o VEGFR-2, antes do teste em células endoteliais primárias <sup> 10,26. O ensaio é particularmente útil para a pesquisa rápida de mutantes de VEGF, que pode ser rapidamente avaliada para a actividade antes de serem introduzidas para os ensaios de células endoteliais mais trabalhoso 25 ou no momento da avaliação para os protocolos de purificação de crescimento Factores de 27.
O ensaio descrevemos é fácil de realizar, e na versão semi-quantitativa permite determinações rápidas que são por vezes necessários ao monitorar a produção ou purificação de factores de crescimento, anticorpos ou domínios de receptores solúveis para outras experiências. A facilidade de utilização do ensaio torna um complemento ideal para estudos mais e mais completas realizados com células endoteliais primárias derivadas do sangue ou vasos linfáticos a partir de tecidos específicos ou de sistemas de órgãos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio aqui descrito baseia-se na utilização de células de alta viabilidade, que são dependentes de factores de crescimento. portanto, as células devem ser cuidadosamente cultivadas para garantir que eles são dependentes do fator, e manter a expressão do receptor quimérico. Garantir que o meio é frescos e não armazenados por um período excessivamente longo e que WEHI-3D CM é altamente ativo é importante. As células têm de ser cuidadosamente lavadas de IL-3 contendo o meio para o meio de ensaio par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
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