Un bioessai simple pour l'évaluation des facteurs de croissance endothélial vasculaire
Summary
Nous décrivons un test biologique simple, basée sur des cellules pour la détection, la quantification et le suivi de l'activité des membres de la famille du facteur de croissance endothélial vasculaire des ligands. L'essai utilise des récepteurs chimères exprimés dans une lignée cellulaire dépendant du facteur de fournir une évaluation semi-quantitative ou quantitative de la liaison au récepteur et la réticulation par le ligand.
Abstract
L'analyse des tyrosine kinases des récepteurs et leurs ligands impliqués dans l'interaction de la biologie vasculaire est souvent difficile en raison de l'expression constitutive de la famille des récepteurs apparentés, une large gamme de ligands associés et de la difficulté de traiter des cultures primaires de cellules endotheliales spécialisées. Nous décrivons ici un essai biologique pour la détection de ligands du facteur de croissance vasculaire endothélial récepteur-2 (VEGFR-2), un transducteur de signaux clés qui favorisent l'angiogenèse et la lymphangiogenèse. Un ADNc codant pour une fusion de la région extracellulaire (liaison de ligand) de VEGFR-2 avec les régions transmembranaires et cytoplasmiques du récepteur de l'érythropoïétine (EpoR) est exprimée dans la lignée cellulaire dépendante du facteur de Ba / F3. Cette lignée cellulaire se développe en présence d'interleukine-3 (IL-3) et le retrait de ce facteur entraîne la mort des cellules dans les 24 heures. L'expression de la / EpoR fusion du récepteur VEGFR-2 fournit un autre mécanisme pour favoriser la survie et potentially prolifération de cellules Ba / F3 transfectées de façon stable en présence d'un ligand capable de se lier et de réticulation de la partie extracellulaire de la protéine de fusion ( par exemple, celui qui peut réticuler la région extracellulaire du VEGFR-2). Le test peut être réalisé de deux façons: une approche semi-quantitative dans laquelle de petits volumes de ligand et les cellules permettent un résultat rapide en 24 heures, et une approche quantitative impliquant des marqueurs de substitution d'un certain nombre de cellules viables. L'essai est relativement facile à réaliser, est très sensible à VEGFR-2 connus et peuvent accueillir des ligands inhibiteurs extracellulaires de VEGFR-2 de signalisation tels que des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur ou des ligands et des pièges de ligands solubles.
Introduction
La famille de facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), les facteurs de croissance des protéines sécrétées et leurs congénères des récepteurs de surface cellulaire est un groupe important et diversifié de ligands solubles et des récepteurs de la membrane-embedded, respectivement cette fonction dans la transduction des signaux à travers les membranes cellulaires. Ils fonctionnent principalement dans les cellules endothéliales , mais également dans des cellules d'origine épithéliale et ceux du 1,2- du système immunitaire. Les voies de signalisation engagées par les récepteurs activés par des ligands VEGF (VEGFR) sont essentiels dans des pathologies majeures telles que la dégénérescence et le cancer maculaire liée à l'âge, et les thérapeutiques qui leur sont destinés sont en utilisation clinique fréquente (par exemple, le bevacizumab anticorps monoclonal qui cible VEGF-A) 3,4.
L'une des complexités de la famille de VEGF est la diversité des ligands solubles présents dans la nature (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, les protéines de VEGF codées par le orf de famille des virus parapox et venin de serpent VEGF, ainsi que d'autres inhibiteurisoformes du VEGF-A) 2.
Ces ligands interagissent avec les trois membres de la famille tyrosine kinase du récepteur, à savoir VEGFR-1, VEGFR-2 et VEGFR-3. Ces récepteurs sont variablement exprimés sur différents types de cellules , mais sont souvent co-exprimés sur la surface des cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins et lymphatiques de toutes tailles 5. VEGFR-2 peut se lier à des ligands de mammifère VEGF-A 6, le VEGF-C et VEGF-7 8,9 D ainsi que le virus orf VEGF 10 et 11 de venin de serpent VEGF. VEGFR-2 joue un rôle majeur dans l'angiogenèse (la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants) dans le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, le cancer et les maladies oculaires conduite. Dans ces contextes, les ligands tels que le VEGF-A, -C et -D se lient et activent le récepteur sur les cellules endothéliales vasculaires sanguines 12-15. Sur les cellules endothéliales lymphatiques, VEGFR-2 joue un rôle dans la lymphangiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques 16. VEGFR2 peut également favoriser la dilatation et de l' expansion des grandes artères et des vaisseaux lymphatiques dans les tissus et les maladies 17 sains. Une compréhension complète de VEGFR-2: interactions ligand est donc important pour le développement d'inhibiteurs pour une utilisation dans le traitement de maladies dépendantes de l' angiogenèse 18. Alors que la plupart des isoformes du VEGF-A se lient à VEGFR-2, le clivage protéolytique de VEGF-C et VEGF-D est nécessaire pour libérer un fragment constitué par le domaine VEGF-homologie qui présente la liaison à VEGFR-2 19,20 haute affinité.
Nous avons mis au point un test biologique pour surveiller les ligands de VEGFR-2 qui est conçu pour contourner la nécessité pour les cellules endothéliales primaires, qui sont techniquement difficiles à passage, coûteux à l' achat et de la culture (nécessitant moyen spécialisé) 21 et d' exprimer plusieurs VEGFR et co – associé 22 récepteurs. Hétérodimérisation de VEGFR-2 avec d'autres récepteurs du VEGF ou co-récepteurs peut provoquer la complexité indésirable lorsque l'on cherche à goujoninteractions y binaires récepteur-ligand, en évaluant l' activité attribuable à un récepteur spécifique, ou évaluant l'effet des réactifs inhibiteurs. 23. L'essai biologique conserve la mobilité du récepteur concerné dans la membrane cellulaire et permet d'évaluer la capacité d'un ligand à se lier et à réticuler la région extracellulaire de VEGFR-2.
L'essai biologique repose sur la création d'un récepteur chimère dans lequel la région extracellulaire d'un récepteur de VEGF (dans ce cas, VEGFR-2) est fusionnée à l'extrémité régions transmembranaires et intracellulaires du récepteur de l'érythropoïétine (EpoR), un membre de la famille des récepteurs de cytokines 8,24. Cette protéine de fusion est ensuite exprimée dans la lignée cellulaire pro-B dépendant du facteur Ba / F3, sur lequel la stimulation avec un ligand capable de se lier et de réticulation du domaine extracellulaire du récepteur entraîne l'activation de la région effectrice cytoplasmique, qui est capable de transduire un signal de survie via Janus kinases (JAK) pour promouvoir la cellulela survie et / ou la prolifération. En revanche, l'expression de pleine longueur de VEGFR-2 dans le même type de cellules et la stimulation avec le ligand, ne favorise pas la survie et la prolifération cellulaire, ce qui indique que les effecteurs de signalisation proximale de la voie de VEGFR-2 ne sont pas disponibles dans ce type de cellule.
Nous avons utilisé le test dans une variété de contextes pour explorer la liaison de nouveaux VEGFR-2 ligands 10,19,20,24-29. En combinaison avec un essai / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, nous avons comparé les activités relatives du VEGF-C et les facteurs de croissance VEGF-D pour la liaison et la réticulation de VEGFR-2 et VEGFR-3 30. L'essai a été utilisé pour caractériser l'activité d' inhibition de la neutralisation des anticorps monoclonaux contre le VEGFR-2 ou VEGF-D, soluble dans VEGFR-2 et le piège peptidomimétiques ciblant la famille VEGF 31. L'essai a également été utilisé pour montrer la capacité de VEGF à partir de différentes souches de virus orf de lier et de cross-link VEGFR-2 avant le test dans les cellules endothéliales primaires <sup> 10,26. L'essai est particulièrement utile pour le criblage rapide de mutants de VEGF qui peuvent être rapidement évaluées pour l' activité avant qu'ils ne soient introduits dans les dosages de cellules endothéliales plus laborieuse lorsque les protocoles 25 ou l' évaluation de la croissance de purification 27 facteurs.
L'essai, nous décrivons est facile à réaliser, et la version semi-quantitative permet des déterminations rapides qui sont parfois nécessaires lors de la surveillance de la production ou la purification des facteurs de croissance, des anticorps ou des domaines de récepteurs solubles pour d'autres expériences. La facilité d'utilisation de l'essai, il est un complément idéal à d'autres études et plus complètes réalisées avec des cellules endothéliales primaires dérivées de vaisseaux sanguins ou lymphatiques à partir de tissus spécifiques ou systèmes d'organes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'essai décrit ici repose sur l'utilisation de cellules de grande viabilité, qui dépendent des facteurs de croissance. Les cellules doivent donc être soigneusement cultivées pour assurer qu'ils sont le facteur de charge, et de conserver l'expression du récepteur chimérique. Veiller à ce que le milieu est fraîchement préparé et non stocké pendant une période excessivement longue et que WEHI-CM 3D est très actif est important. Les cellules doivent être soigneusement lavés à partir de IL-3 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.
Materials
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | N/A | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | N/A | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
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