A técnica eletrofisiológica da gravação intracelular é demonstrado e usado para determinar sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras único no olho composto de uma borboleta.
gravação intracelular é uma técnica poderosa usada para determinar a forma como uma única célula podem responder a um dado estímulo. Na pesquisa visão, a gravação intracelular tem sido historicamente uma técnica comum usada para estudar as sensibilidades de células fotorreceptoras individuais a diferentes estímulos luminosos que ainda está sendo usado hoje. No entanto, continua a existir uma carência de metodologia detalhada na literatura para os investigadores que desejam replicar experiências de gravação intracelulares no olho. Aqui nós apresentamos o inseto como um modelo para examinar a fisiologia do olho em geral. células fotorreceptoras de insectos estão localizados perto da superfície do olho e são, portanto, fácil de alcançar, e muitos dos mecanismos envolvidos na visão são conservadas entre filos animais. Nós descrevemos o procedimento básico para in vivo de gravação intracelular de células fotorreceptoras no olho de uma borboleta, com o objetivo de tornar esta técnica mais acessível a pesquisadores com pouca experiência anterior em electrophysiology. Introduzimos o equipamento básico necessário, como preparar uma borboleta vivo para o registo, o modo de inserir um microeléctrodo de vidro em uma única célula, e, finalmente, o processo de gravação em si. Nós também explicar a análise básica de dados de resposta matérias para determinar sensibilidade espectral de tipos de células individuais. Embora o protocolo centra-se na determinação da sensibilidade espectral, outros estímulos (por exemplo, luz polarizada) e variações do método são aplicáveis a esta configuração.
As propriedades eléctricas de células tais como neurónios são observadas através da medição do fluxo de iões através das membranas celulares, como uma mudança na tensão ou corrente. Uma variedade de técnicas electrofisiológicas foram desenvolvidos para medir bioeléctico eventos em células. Os neurónios encontrados nos olhos dos animais são acessíveis e os seus circuitos muitas vezes é menos complexa do que no cérebro, fazendo com que estas células bons candidatos para estudo electrofisiológico. As aplicações comuns de eletrofisiologia no olho incluem eletrorretinografia (ERG) 1,2 e microeletrodos de gravação intracelular. ERG envolve a colocação de um eléctrodo dentro ou sobre o olho de um animal, aplicando-se um estímulo de luz e medindo a variação de tensão como a soma de todas as respostas de células vizinhas 3-6. Se alguém está interessado especificamente na caracterização sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras individuais, muitas vezes vários tipos de células respondem simultaneamente em diferentes pontos fortes para um dado estímulo; assimpode ser difícil determinar a sensibilidade de tipos específicos de células a partir de dados do ERG especialmente se houver vários tipos diferentes de células fotorreceptoras espectralmente semelhantes no olho. Uma possível solução é criar transgênicos Drosophila com o gene fotorreceptor (opsina) de interesse expressa nas células maioria R1-6 no olho e depois executar ERGs 7. Desvantagens potenciais deste método incluem não a baixa expressão da proteína fotorreceptor 8, eo período de tempo longo para a geração e triagem de animais transgênicos. Para os olhos, com menor número de tipos de fotorreceptores espectralmente distintos, a adaptação do olho com filtros coloridos podem ajudar com a redução da contribuição de alguns tipos de células para o ERG, permitindo assim a estimativa da sensibilidade espectral máximos 9.
gravação intracelular é uma outra técnica em que uma multa eletrodo espeta uma célula e um estímulo é aplicado. Os registros de eletrodos só isso indivA resposta de células idual para que a gravar e analisar várias células individuais podem produzir sensibilidades específicas de fisiologicamente diferentes tipos de células 10-14. Embora o nosso protocolo centra-se na análise de sensibilidade espectral, os princípios básicos da intracelular de gravação com eletrodos pontiagudos são modificáveis para outras aplicações. Usando uma preparação diferente de uma amostra, por exemplo, e usando eléctrodos de quartzo afiadas, um pode gravar a partir de mais profundo no lobo óptica ou outras regiões do cérebro, de acordo com a questão que se coloca. Por exemplo, os tempos de resposta de células fotorreceptoras individuais 15, a actividade de células na óptica lóbulos 16 (lâmina, medula ou lobula 17), cérebro 18 ou outros gânglios 19 também podem ser gravadas com técnicas semelhantes, ou estímulos de cor pode ser substituído com polarização 20 -22 ou movimento estímulos 23,24.
Fototransdução, o processo pelo qual a luzenergia é absorvida e transformada em um sinal eletroquímico, é uma característica antiga comum a quase todos os dias atuais filos animais 25. O pigmento visual encontrado em células fotorreceptoras e responsável por iniciar fototransdução visual é rodopsina. Rodopsinas em todos os animais são constituídos por uma proteína opsina, um membro da família G transmembranar sete do receptor acoplado à proteína, e um cromóforo associado que é derivada de uma molécula de retina ou semelhantes 26,27. Opsina sequência de aminoácidos e estrutura cromóforo afectar a absorvência da rodopsina para diferentes comprimentos de onda de luz. Quando um fotão é absorvido pelo cromóforo a rodopsina torna-se activa, iniciando uma cascata de proteína G na célula que, em última análise conduz à abertura de canais iónicos ligados à membrana 28. Diferentemente da maioria dos neurônios, células fotorreceptoras sofrer alterações potenciais graduados que podem ser medidos como uma mudança relativa na amplitude da resposta com a mudança de estímulo luminoso. Tipicamente, uma dadaTipo de fotorreceptores expressa apenas um gene da opsina (embora existam exceções 8,10,29-31). visão de cores sofisticada, do tipo encontrado em muitos vertebrados e artrópodes, é conseguido com um olho complexo de centenas ou milhares de células fotorreceptoras cada expressando mais uma ou ocasionalmente tipos rodopsina. A informação visual é capturado por comparação das respostas sobre o mosaico de fotorreceptores via de sinalização a jusante neural complexo no olho e no cérebro, resultando na percepção de uma imagem completa a cores e com movimento.
Depois de medir as respostas de matérias de uma das células fotorreceptoras para diferentes comprimentos de onda da luz de gravação via intracelular, é possível calcular a sensibilidade espectral. Este cálculo baseia-se no princípio de Univariance, o que indica que a resposta de uma célula de fotorreceptores é dependente do número de fotões que absorve, mas não sobre as propriedades particulares dos fotões que absorve 32. Qualquer fotões que é absorbed por rodopsina irão induzir o mesmo tipo de resposta. Na prática, isto significa que a amplitude de resposta em bruto de uma célula irá aumentar devido a um aumento na intensidade da luz (mais fotões de absorver), ou a uma mudança no comprimento de onda para a sua sensibilidade de pico (maior probabilidade de rodopsina absorvendo esse comprimento de onda). Nós fazemos uso deste princípio em relacionar as respostas celulares a uma intensidade conhecida e ao mesmo comprimento de onda de respostas em diferentes comprimentos de onda e na mesma intensidade, mas sensibilidade relativa desconhecida. Os tipos de células são frequentemente identificado pelo comprimento de onda a que os seus picos de sensibilidade.
Aqui nós mostramos um método para gravação e análise de sensibilidade espectral de fotorreceptores no olho de uma borboleta intracelular, com um foco em tornar este método mais acessível à comunidade científica em geral. Embora a gravação intracelular continua a ser comum na literatura, particularmente com respeito à visão de cores em insetos, encontramos that descrições de materiais e métodos são geralmente demasiado curto para permitir a reprodução da técnica. Nós apresentamos este método em formato de vídeo com o objectivo de permitir sua replicação mais fácil. Descrevemos também a técnica de utilização de equipamento de fácil obtenção e acessível. Abordamos ressalvas comuns que muitas vezes não são relatados, que retardam a investigação ao otimizar uma técnica nova e complexa.
gravação intracelular pode ser uma técnica difícil de dominar, devido aos muitos passos técnicos envolvidos. Para experiências com sucesso vários pontos importantes devem ser considerados. Em primeiro lugar, é importante ter uma tabela adequadamente vibratoriamente-isolado no qual é realizada a experiência. Muitos pesquisadores usam tabelas de ar, que separam completamente a mesa a partir da base, dando isolamento de vibração superior. Nossa configuração envolve uma mesa de mármore de espessura com uma ca…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao final de Rudy Limburg para fabricar as perímetro de braço cardan, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate para nos emprestar equipamentos e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, para o incentivo. Este trabalho foi apoiado por uma National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship para KJM e concessão NSF IOS-1257627 para ADB
Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
Stereomicroscope, 6x, 12x, 25x, 50x magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
Marble table | |||
Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
Manipulator | Carl Zeiss – Jena | ||
Electrode holder | |||
Specimen stage | |||
Alligator clip wires for grounding | |||
Insulated copper wire | |||
Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
BNC cables | |||
Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
Oscilloscope, 30MHz, 2CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
BNC T-adapter | |||
Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
Potassium chloride, 3 M | |||
Slotted plastic tube | |||
Low melting temperature wax | |||
Soldering Iron | Weller | ||
Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
Vaseline | |||
Microsoft Excel | Microsoft |