La tecnica elettrofisiologica di registrazione intracellulare è dimostrato e utilizzato per determinare la sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli nell'occhio composto di una farfalla.
registrazione intracellulare è una tecnica potente usato per determinare come una singola cellula può rispondere ad un dato stimolo. Nella ricerca visione, la registrazione intracellulare è stata storicamente una tecnica comune usata per studiare la sensibilità di cellule visive individuali a diversi stimoli luminosi che è ancora in uso oggi. Tuttavia, rimane una carenza di metodologia dettagliata nella letteratura per i ricercatori che desiderano replicare gli esperimenti di registrazione intracellulare negli occhi. Qui vi presentiamo l'insetto come modello per l'esame fisiologia dell'occhio, più in generale. fotorecettori insetti si trovano vicino alla superficie dell'occhio e sono quindi facilmente raggiungibili, e molti dei meccanismi coinvolti nella visione si conservano tutta phyla animali. Descriviamo la procedura di base per la registrazione in vivo intracellulare di cellule visive negli occhi di una farfalla, con l'obiettivo di rendere questa tecnica più accessibile ai ricercatori con poca esperienza precedente in electrophysiology. Introduciamo l'attrezzatura di base, come preparare una farfalla reale per la registrazione, come inserire un microelettrodo di vetro in una singola cella, e infine la procedura di registrazione stessa. Spieghiamo anche l'analisi di base dei dati di risposta prime per determinare la sensibilità spettrale di tipi di cellule individuali. Sebbene il protocollo concentra sulla determinazione sensibilità spettrale, altri stimoli (ad esempio, la luce polarizzata) e variazioni del metodo sono applicabili a questa configurazione.
Le proprietà elettriche delle cellule come i neuroni si osservano misurando il flusso di ioni attraverso le membrane cellulari come un cambiamento di tensione o corrente. Una varietà di tecniche elettrofisiologiche sono state sviluppate per misurare eventi bioelettrici nelle cellule. I neuroni trovati nelle occhi degli animali sono accessibili e loro circuiti è spesso meno complesso nel cervello, rendendo queste cellule buoni candidati per lo studio elettrofisiologico. Le applicazioni più comuni di elettrofisiologia negli occhi includono elettroretinografia (ERG) 1,2 e microelettrodi registrazione intracellulare. ERG prevede il posizionamento di un elettrodo o sull'occhio di un animale, applicando un stimolo luminoso, e misurando la variazione di tensione come somma delle risposte di tutte le celle vicine 3-6. Se uno è specificamente interessati a caratterizzare sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli, spesso contemporaneamente più tipi di cellule rispondono a diversi punti di forza per un dato stimolo; cosìpuò essere difficile determinare la sensibilità di specifici tipi cellulari a partire da dati ERG soprattutto se ci sono diversi tipi di fotorecettori spettralmente-simili negli occhi. Una possibile soluzione è quella di creare transgenici Drosophila con il fotorecettore (opsina) gene di interesse espressa nelle cellule di maggioranza R1-6 negli occhi e quindi eseguire ERGs 7. I potenziali svantaggi di questo metodo includono non a bassa espressione della proteina fotorecettore 8, e il periodo di tempo lungo per la generazione e lo screening di animali transgenici. Per gli occhi con un minor numero di tipi di fotorecettori spettralmente distinti, l'adattamento dell'occhio con filtri colorati può aiutare con la riduzione del contributo di alcuni tipi di cellule per l'ERG, in tal modo consentendo la stima della sensibilità spettrale massimi 9.
registrazione intracellulare è un'altra tecnica nella quale un elettrodo multa infilza una cella e viene applicato uno stimolo. I record elettrodi solo indivLa risposta di cellule idual in modo che la registrazione e l'analisi più celle individuali può produrre sensibilità specifiche delle fisiologicamente diversi tipi di cellule 10-14. Anche se il nostro protocollo si concentra sulla analisi della sensibilità spettrale, i principi fondamentali della intracellulare registrazione con elettrodi appuntiti sono modificabili per altre applicazioni. Usando una differente preparazione di un campione, per esempio, e utilizzando elettrodi quarzo taglienti, si può registrare dalla profonda nel lobo ottico o altre regioni del cervello, a seconda della domanda viene chiesto. Ad esempio, i tempi di risposta dei singoli fotorecettori 15, attività cellulare nell'ottica lobi 16 (lamina midollare o lobula 17), cervello 18 o altri gangli 19 possono anche essere registrati con tecniche simili, o stimoli di colore potrebbe essere sostituito con polarizzazione 20 -22 o movimento sTIMOLI 23,24.
Fototrasduzione, il processo attraverso il quale la lucel'energia viene assorbita e convertita in un segnale elettrochimico, è un antico tratto comune a quasi tutti i presenti il giorno 25 phyla animali. Il pigmento visivo trovato nelle cellule fotorecettori e responsabile per l'avvio fototrasduzione visivo è rodopsina. Rhodopsins in tutti gli animali sono costituiti da una proteina opsin, membro del 7 transmembrana G famiglia dei recettori accoppiati alle proteine, e un cromoforo associato che deriva dalla retina o una molecola simile 26,27. Opsina sequenza di aminoacidi e la struttura cromofori influenzare l'assorbanza della rodopsina a diverse lunghezze d'onda della luce. Quando un fotone viene assorbito dal cromoforo rodopsina viene attivato, avviando una cascata proteina G nella cella che conduce verso l'apertura dei canali ionici di membrana 28. Diversamente dalla maggior parte dei neuroni, le cellule fotorecettori subiscono potenziali cambiamenti graduali che possono essere misurati come una variazione relativa di ampiezza risposta con il cambiamento stimolo luminoso. Tipicamente un determinatoTipo fotorecettore esprime un solo gene opsina (anche se esistono eccezioni 8,10,29-31). visione del colore sofisticata, del tipo presente in molti vertebrati e artropodi, si ottiene con un occhio complesso di centinaia o migliaia di cellule visive ogni esprimono uno o più tipi di tanto in tanto rodopsina. informazioni Visual viene catturato confrontando risposte oltre il mosaico fotorecettore tramite complesso segnalazione neurale valle nell'occhio e nel cervello, provocando la percezione di un'immagine completa di colori e movimento.
Dopo aver misurato le risposte grezzi di una cellula fotorecettore a diverse lunghezze d'onda della luce tramite registrazione intracellulare, è possibile calcolare la sua sensibilità spettrale. Questo calcolo è basato sul principio di Univariance, che afferma che la risposta di una cellula fotorecettore è dipendente dal numero di fotoni assorbe, ma non sulle particolari proprietà dei fotoni assorbe 32. Ogni fotone che è Absorbed da rodopsina indurrà lo stesso tipo di risposta. In pratica, ciò significa che l'ampiezza risposta grezzo di una cella aumenterà dovuti a un aumento dell'intensità della luce (più fotoni per assorbire), o ad un cambiamento nella lunghezza d'onda verso la sua sensibilità di picco (maggiore probabilità di rodopsina assorbire quella lunghezza d'onda). Noi facciamo uso di questo principio nel relativo risposte cellulari ad intensità nota e la stessa lunghezza d'onda di risposte a diverse lunghezze d'onda e la stessa intensità ma sconosciuto sensibilità relativa. Le cellule sono spesso identificati dalla lunghezza d'onda alla quale loro picchi di sensibilità.
Qui vi mostriamo un metodo per la registrazione e l'analisi di sensibilità spettrale dei fotorecettori negli occhi di una farfalla intracellulare, con una particolare attenzione per rendere questo metodo più accessibile alla comunità di ricerca più ampia. Sebbene registrazione intracellulare tuttora comune in letteratura, in particolare relativamente alla visione dei colori in insetti, abbiamo trovato that descrizioni di materiali e metodi sono generalmente troppo breve per consentire una riproduzione della tecnica. Presentiamo questo metodo in formato video allo scopo di consentire la replicazione facile. Descriviamo anche la tecnica utilizzando attrezzature facilmente reperibili ea prezzi accessibili. Ci rivolgiamo avvertimenti comuni che spesso non sono segnalati, che rallentano la ricerca quando l'ottimizzazione di una nuova e complessa tecnica.
registrazione intracellulare può essere una tecnica difficile da padroneggiare a causa dei molti passaggi tecnici coinvolti. Per gli esperimenti di successo devono essere considerati diversi punti importanti. In primo luogo, è importante avere una tabella correttamente vibrazionalmente-isolato su cui viene eseguita l'esperimento. Molti ricercatori utilizzano le tabelle d'aria, che separano completamente il tavolo dalla base, dando isolamento dalle vibrazioni superiori. La nostra messa a punto prevede un tavolo…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il ritardo Rudy Limburgo per fabbricare le perimetro del braccio cardanici, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate per averci prestato attrezzature, e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, per incoraggiamento. Questo lavoro è stato sostenuto da una National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship per KJM e Grant NSF IOS-1.257.627 a ADB
Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
Stereomicroscope, 6x, 12x, 25x, 50x magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
Marble table | |||
Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
Manipulator | Carl Zeiss – Jena | ||
Electrode holder | |||
Specimen stage | |||
Alligator clip wires for grounding | |||
Insulated copper wire | |||
Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
BNC cables | |||
Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
Oscilloscope, 30MHz, 2CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
BNC T-adapter | |||
Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
Potassium chloride, 3 M | |||
Slotted plastic tube | |||
Low melting temperature wax | |||
Soldering Iron | Weller | ||
Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
Vaseline | |||
Microsoft Excel | Microsoft |