Bestimmung der Sehzellen Spektrale Empfindlichkeit in einem Insekt Modell aus<em> In Vivo</em> Intrazellulärer Recordings
Summary
Die elektrophysiologische Technik der intrazellulären Aufnahme wird gezeigt, und verwendet, um spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen in der Verbindung Auge eines Schmetterlings bestimmen.
Abstract
Intrazellulärer Aufnahme ist eine leistungsfähige Technik verwendet, um zu bestimmen, wie eine einzelne Zelle auf einen gegebenen Reiz reagieren. In einer Vision Forschung, hat die intrazelluläre Aufnahme war in der Vergangenheit eine übliche Technik zu studieren Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen auf verschiedene Lichtreize verwendet, die noch heute verwendet wird. Es bleibt jedoch ein Mangel an detaillierten Methodik in der Literatur für die Forscher die intrazelluläre Aufnahme Experimente im Auge zu replizieren wollen. Hier präsentieren wir das Insekt als Modell für die Untersuchung Augenphysiologie allgemeiner. Insekten Sehzellen sind in der Nähe der Oberfläche des Auges angeordnet und sind daher leicht zu erreichen, und viele der Mechanismen in der Vision beteiligt sind, über Tierphyla konserviert. Wir beschreiben das grundlegende Verfahren für in vivo intrazelluläre Aufnahme von Sehzellen im Auge eines Schmetterlings, mit dem Ziel, diese Technik für Forscher mit wenig Erfahrung in electrophysiology. Wir stellen die Grundausstattung benötigt, wie ein Live-Schmetterling zur Vorbereitung der Aufnahme, wie ein Glas-Mikroelektrode in eine einzelne Zelle einfügen, und schließlich die Aufnahmeverfahren selbst. Wir erklären auch die grundlegende Analyse der rohen Reaktionsdaten für die spektrale Empfindlichkeit der einzelnen Zelltypen zu bestimmen. Obwohl unser Protokoll über die Bestimmung spektraler Empfindlichkeit konzentriert, andere Reize (zB polarisiertes Licht) und Variationen des Verfahrens sind zu diesem Setup anwendbar.
Introduction
Die elektrischen Eigenschaften von Zellen, wie Neuronen werden durch Messen Ionenfluss durch die Zellmembranen als Änderung der Spannung oder des Stroms beobachtet. Eine Vielzahl von elektrophysiologischen Techniken entwickelt worden bioelektrischen Ereignisse in Zellen zu messen. Neurone in den Augen von Tieren zugänglich sind und ihre Schaltungsanordnung ist oft weniger komplex als im Gehirn, diese Zellen gute Kandidaten für eine elektrophysiologische Untersuchung zu machen. Gängige Anwendungen von Elektro im Auge umfassen Elektroretinogramm (ERG) 1,2 und Mikroelektroden intrazelluläre Aufnahme. ERG beinhaltet in oder auf dem Auge eines Tieres eine Elektrode platziert, ein Lichtreiz Anwendung und Messung der Änderung der Spannung als Summe der Antworten aller Zellen in der Nähe 3-6. Wenn man bei der Charakterisierung von spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen speziell interessiert ist, oft mehrere Zelltypen gleichzeitig an verschiedenen Stärken auf einen bestimmten Reiz reagieren; somitschwierig sein kann, die Empfindlichkeiten von spezifischen Zelltypen aus ERG-Daten zu bestimmen, insbesondere dann, wenn verschiedene Arten von spektral ähnlichen Sehzellen im Auge sind. Eine mögliche Lösung ist transgene Drosophila mit dem Photorezeptor (Opsin) Gen von Interesse in den meisten R1-6 Zellen im Auge ausgedrückt zu schaffen und führen Sie dann ERG 7. Mögliche Nachteile dieser Methode sind nicht zu niedrig Expression des Proteins Photorezeptor 8, und die lange Zeitrahmen für die Erzeugung und das Screening von transgenen Tieren. Für Augen mit weniger Arten von spektral unterschiedlichen Photorezeptoren, die Anpassung des Auges mit farbigen Filter können mit Absenken der Beitrag einiger Zelltypen zu dem ERG, wodurch Schätzung der spektralen Empfindlichkeitsmaxima 9 helfen.
Die intrazelluläre Aufnahme ist eine weitere Technik, wo eine feine Elektrode, die eine Zelle und ein Stimulus spießt angewendet wird. Die Elektrodenaufzeichnungen nur, dass indivIdual Zelle Antwort , so dass von der Aufnahme und mehreren einzelnen Zellen 10-14 spezifischen Empfindlichkeiten von physiologisch unterschiedlichen Zelltypen zu analysieren ergeben. Obwohl unser Protokoll auf der Analyse der spektralen Empfindlichkeit konzentriert, sind die grundlegenden Prinzipien der intrazellulären Aufnahme mit scharfen Elektroden für andere Anwendungen modifizierbar. Mit einer anderen Vorbereitung einer Probe, zum Beispiel, und mit scharfen Quarzelektroden kann man aus tiefer in den optischen Loben oder anderen Regionen im Gehirn, die sich an der Frage abhängig gefragt. Zum Beispiel Antwortzeiten einzelner Sehzellen 15, Zell – Aktivität in den optischen Loben 16 (Lamina, Medulla oder Lobula 17), Gehirn 18 oder andere Ganglien 19 kann auch mit ähnlichen Techniken aufgezeichnet werden, oder Farbreize mit Polarisation ersetzt werden könnte 20 -22 oder Bewegungsreize 23,24.
Phototransduktion, das Verfahren, mit dem LichtEnergie absorbiert und in ein elektrochemisches Signal, ist ein altes Merkmal gemeinsam fast alle heutigen Tierstämme 25. Die visuelle Pigment gefunden in Sehzellen und verantwortlich für Phototransduktion Einleitung ist Rhodopsin. Rhodopsine in allen Tieren sind aus einem Opsin – Protein, einem Mitglied der 7 transmembranen G – Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie und ein zugehöriges Chromophor hergestellt , das aus der Netzhaut oder ein ähnliches Molekül 26,27 ableitet. Opsin Aminosäuresequenz und chromophore Struktur beeinflussen die Absorption von auf verschiedene Wellenlängen von Licht Rhodopsin. Wenn ein Photon durch den Chromophor absorbiert wird das Rhodopsin aktiviert wird, einen G-Protein – Kaskade in der Zelle initiiert, die an der Öffnung der membrangebundenen Ionenkanäle 28 schließlich führt. Anders als die meisten Neuronen unterziehen Sehzellen abgestufter Potentialänderungen, die Lichtreizes als relative Änderung der Reaktionsamplitude mit wechselnden gemessen werden kann. Typischerweise eine gegebenePhotorezeptortyp drückt nur ein Opsin – Gen (obwohl Ausnahmen existieren 8,10,29-31). Anspruchsvolle Farbsehen, wie sie in vielen Wirbeltieren und Gliederfüßern gefunden wird, wird mit einem komplexen Auge von Hunderten oder Tausenden von Sehzellen erreicht jeweils ein oder gelegentlich mehr Rhodopsin Arten ausdrücken. Visuelle Information wird durch den Vergleich Antworten, die über dem Fotoaufnehmer Mosaik über komplexe nachgeschalteten neuronalen Signalisierung im Auge und Gehirn erfasst, was in der Wahrnehmung eines Bildes komplett mit Farbe und Bewegung.
die rohen Antworten eines Sehzellen auf unterschiedliche Wellenlängen des Lichts über die intrazelluläre Aufnahme Nach der Messung ist es möglich, seine spektrale Empfindlichkeit zu berechnen. Diese Berechnung basiert auf dem Prinzip der Univariance, die besagt , dass eine Reaktion der Photorezeptorzelle auf der Zahl der Photonen abhängig ist, aber nicht auf die besonderen Eigenschaften der Photonen absorbiert es 32 absorbiert. Jedes Photon, das abso istrbed von Rhodopsin wird die gleiche Art von Reaktion induzieren. In der Praxis bedeutet dies , dass eine rohe Reaktionsamplitude der Zelle entweder aufgrund einer Erhöhung der Lichtintensität (mehr Photonen zu absorbieren) zu erhöhen, oder zu einer Verschiebung der Wellenlänge in Richtung auf seine maximale Empfindlichkeit (höhere Wahrscheinlichkeit von Rhodopsin , dass die Wellenlänge absorbieren). Wir nutzen dieses Prinzip in Bezug zellulären Reaktionen bei bekannter Intensität und der gleichen Wellenlänge zu Reaktionen bei unterschiedlichen Wellenlängen und der gleichen Intensität, aber unbekannten relative Empfindlichkeit. Zelltypen werden oft von der Wellenlänge, bei der ihre Empfindlichkeit Peaks identifiziert.
Hier zeigen wir eine Methode für die intrazelluläre Aufnahme und Analyse der spektralen Empfindlichkeit von Photorezeptoren im Auge eines Schmetterlings, mit einem Fokus auf machen diese Methode besser zugänglich zu der weiteren Forschung. Obwohl die intrazelluläre Aufnahme in der Literatur häufig bleibt, vor allem in Bezug auf das Farbsehen bei Insekten, haben wir gefunden, that Beschreibungen der Materialien und Verfahren sind in der Regel zu kurz für die Wiedergabe der Technik zu ermöglichen. Wir präsentieren diese Methode im Video-Format mit dem Ziel, die leichter Replikation ermöglicht. Wir beschreiben auch die Technik leicht erhältlich und preisgünstige Ausrüstung. Wir wenden uns an gemeinsamen Vorbehalte, die oft nicht gemeldet werden, die Forschung verlangsamen, wenn eine neue und komplexe Technik zu optimieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die intrazelluläre Aufnahme kann eine schwierige Technik, aufgrund der vielen technischen Schritte zu meistern beteiligt. Für eine erfolgreiche Experimente müssen einige wichtige Punkte berücksichtigt werden. Erstens ist es wichtig, eine richtig schwingungsisolierten Tisch zu haben, an dem das Experiment durchgeführt wird. Viele Forscher verwenden Luft-Tabellen, die vollständig die Tischplatte von der Basis trennen, überlegene Schwingungsisolierung zu geben. Unser Setup beinhaltet einen dicken Marmortisch mit ein…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem späten Rudy Limburg für die Kardan Armumfang Herstellung, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, und Raju Metherate uns Ausrüstung für die Kreditvergabe, und Almut Kelber und Kentaro Arikawa, für Ermutigung. Diese Arbeit wurde von einem National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship an KJM und NSF Zuschuss IOS-1257627 ADB unterstützt
Materials
| Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
| Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
| Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
| 100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
| Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
| Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
| No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
| Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
| Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
| Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
| Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
| Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
| Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
| Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
| Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
| Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
| Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
| 600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
| Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
| UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
| LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
| Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
| SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
| Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
| Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
| Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
| Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
| Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
| Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
| Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
| Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
| Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
| Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
| Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
| Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
| Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
| Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
| Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
| Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
| Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
| Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
| Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
| Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
| Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
| Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
| Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
| Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
| Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
| Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
| Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
| Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
| Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
| Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
| Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
| Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
| Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
| Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
| Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
| Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
| Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
| Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
| Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
| Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
| Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
| Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
| Stereomicroscope, 6x, 12x, 25x, 50x magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
| Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
| Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
| Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
| Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
| Marble table | |||
| Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
| Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
| Manipulator | Carl Zeiss – Jena | ||
| Electrode holder | |||
| Specimen stage | |||
| Alligator clip wires for grounding | |||
| Insulated copper wire | |||
| Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
| BNC cables | |||
| Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
| Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
| Oscilloscope, 30MHz, 2CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
| BNC T-adapter | |||
| Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
| Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
| 10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
| Potassium chloride, 3 M | |||
| Slotted plastic tube | |||
| Low melting temperature wax | |||
| Soldering Iron | Weller | ||
| Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
| Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
| Vaseline | |||
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
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