Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
Анализ диффузии и предметное стекло анализа красителя высвобождения обеспечивают преимущества для обнаружения и характеризации ранее неопознанных белковых препаратов. Эти быстрые и чувствительные методы позволяют с высокой пропускной скрининг библиотек организма источником для идентификации представляющих интерес ферментов до инвестирования большие исследовательские ресурсы. Как идентифицируются высокий профиль целевого ферменты, вариации анализов обнаружения можно использовать для быстрого обнаружения фермента или для определения биохимических свойств фермента. Например, во время многоступенчатой схемы очистки белков, анализ диффузии может быстро предметное стекло обнаружить фракции, содержащие интерес фермент. Кроме того, реакция Optima для фермента может быть определена путем изменения буферов реакции и температуру инкубации в анализе красителем высвобождением.
Диапазон фермента массы, необходимой для обнаружения в анализе диффузии предметное стекло является функцией фермента characteriStics. Обнаружение ограничения анализа в целом требуют использования больших количеств фермента, чем анализом на красителе высвобождением. В данном исследовании сравнение пределов чувствительности анализа диффузии (рис предметное стекло 1) в анализе красителя релиз (рисунок 4) показано , что анализ диффузии является предметное стекло менее чувствительным , чем метод анализа красителя высвобождения. Когда концентрация фермента не является проблемой, анализ позволяет предметное стекло быстрого первоначального скрининга библиотек для производства белковых противомикробных препаратов против целевых субстратов с низкой рабочей силы и оборудования требованиям. Несмотря на то, что требует больше усилий и оборудования, анализ красителем высвобождением является более чувствительным и воспроизводимым, что дает количественные результаты, которые можно было провести сравнение между красителем высвобождением анализов тех же самых или различных ферментов на данной подложке. Эти два метода легко выполняются в большинстве микробиологических лабораторий без необходимости узкоспециализированных приборов. В представитивные анализы, контроль фермент, α-химотрипсин, был обнаружен в количествах , как низко как 100 нг (рисунок 5) с использованием анализа красителя высвобождения, в то время как минимальное количество обнаружено в анализе диффузии предметное стекло было 1 мкг (данные не показаны).
Обеспечение полезности в качестве реакции на обнаружение качественного антимикробных ферментов, ряд вариаций анализа диффузии было зарегистрировано 11,13. При рассмотрении этих анализов, анализ диффузии был разработан предметное стекло для его относительно высокой чувствительности в качестве начального экрана и для его легкости реакции соблюдения. Модифицированный от работы Lachica и др. 11, в котором использовались агарозы накладками для обнаружения производства нуклеаз штаммов золотистого стафилококка, диффузия анализа предметное стекло работает аналогично радиальному способу 14 иммунодиффузии , как белок диффундирует из хорошо в агарозы, содержащей субстрат. Радиальная immunodiffuМетод Sion останавливает расширение зоны иммунопреципитации, когда система достигает равновесия образования комплекса между диффундирующего антигеном и антителом в агарозы. В отличие от этого, субстрат анализа диффузии предметное стекло вначале переварены диффундирующего белка противомикробного в постоянно расширяющейся зоне лизиса окружающих скважину. Растущий диаметр зоны продолжается до тех пор фермент теряет активность или субстрат истощена. Скорость производства зоны лизиса оживлены, как чистота, и таким образом удельной активностью, фермента или концентрация фермента добавляли к увеличению скважины.
Для количественной оценки ферментативной активности белка противомикробных против убитых нагреванием B. Сенная, был выбран анализ красителя релиз. Колориметрические анализы с использованием Remazol бриллиантовый синий R краситель (БОР) меченные субстраты позволяют разностороннее и чувствительную оценку белка противомикробного деятельноти. Ферментативный гидролиз БОР-меченых субстрата приводит к высвобождению растворимых синих продуктов, которые можно легко измерить с помощью спектрофотометра при длине волны 595 нм. Несколько вариантов анализа красителя высвобождения БОР, разработанные, чтобы охарактеризовать другие белковые антимикробные ферменты, показать гибкость этого анализа для применения с другими субстратами. Например, при определении влияния лизостафина бактериолитическим активности, Чжоу, и др., Сообщили анализ красителем высвобождения с использованием БОР окрашенного стафилококковые клетки и стафилококковый пептидогликана в качестве подложки 12. В модифицированном варианте применения данного анализа красителя высвобождения БОР, БОР-меченых Micrococcus Шеиз субстрат был предложен для использования в качестве быстрых и чувствительных средств для диагностики и экран для таких заболеваний, как бактериальные инфекции и наличие злокачественной карциномы, которая может коррелировать с уровнями экспрессии лизоцим человека в сыворотке крови 15. Кроме того, БОР-меченые бактериальные клеточные субстраты имеютLSO был использован в методе zymogram для обнаружения лизоцима 16.
Мы демонстрируем пониженный предел обнаружения, удобство и воспроизводимость анализа красителя релиз, что позволяет для быстрого скрининга библиотек для производства ферментов. Модификации анализа позволяют для последующих количественных биохимических характеристик анализов, в том числе воздействия температуры, рН и солености, а также воздействия других протеолитических ферментов на активность антимикробных белков 6. Кроме того, количественный анализ красителем высвобождения может быть использована для сравнения деятельности нескольких ферментов для данного субстрата. Анализ красителя релиз БОР сообщила полезность для ферментов с активностью в отношении полисахаридов в дополнение к характеристике и детекции белка антимикробных агентов. Петерсон и Eriksson сообщили метод количественного обнаружения endoglycanase активности с использованием аморфных, БОР-крашеные полисахаридные шарики из целлюлозы, ксилана, маннан и читав 17. В расширении этих выводов, чувствительный метод для обнаружения хитиназе ферментов , продуцируемых Bacillus Thuringiensis Bt-107 был разработан с использованием коллоидного хитина , меченного БОР 18. Из этих и других исследований, коммерчески доступные источники БОР окрашенного субстратов появились для использования при выявлении гликолитического активности, в том числе против кератина, амилопектин, амилоза, гликоген, ламинарина, D-ксилана, азо-ячменного глюкана, и крахмал.
В данном исследовании мы показали полезность анализа красителя релиз в формате микропланшетов, уменьшая объем БОР-меченого субстрата и фермента, необходимого для получения колориметрического результата. Как показано на фиг.4 и 5, микропланшет анализ красителем высвобождением обеспечивает более низкий предел обнаружения , чем диффузионный анализа для обнаружения предметное стекло ферментативной активности. Что касается быстрого использования, сохранения труда и простоты интерпретации, микрофонroslide анализ диффузии обеспечивает применение в начальных экранах с высокой пропускной способностью на наличие антимикробной активности, а также указанием антимикробной присутствия белка в нижнем течении изоляции белка и очистки шагов. Сочетание этих двух анализов дополняют друг друга в первоначальном скрининге и конечной характеристика новых белковых противомикробных
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
cork borer | Humboldt | H-9661 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution | |||
agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
|||
250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
|||
200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |