Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
Der Mikrodia Diffusionstest und der Farbstoff-Freisetzungstest bieten Vorteile für den Nachweis und die zuvor nicht identifizierte Protein antimikrobielle Substanzen zu charakterisieren. Diese schnelle und empfindliche Methoden ermöglichen Hochdurchsatzscreening von Organismus-Source-Bibliotheken für die Identifizierung von Enzymen von Interesse vor der größeren Forschungsressourcen zu investieren. Als Hochprofil Zielenzyme identifiziert sind, können Variationen der Nachweistests verwendet werden, um schnell das Enzym nachzuweisen oder biochemischen Eigenschaften des Enzyms zu bestimmen. Zum Beispiel kann der Mikroobjektdiffusionsassay erkennen während eines vielstufigen Proteinreinigungsschema, schnell Fraktionen, die das Enzym von Interesse enthält. Zusätzlich Reaktions optima für das Enzym kann durch Änderung der Reaktionspuffer und Inkubationstemperaturen in dem Farbstoff-Freisetzungstest bestimmt werden.
Der Bereich der Enzymmasse erforderlich für die Detektion in dem Mikroobjektdiffusionsassay ist eine Funktion der Enzym CHARAKTERIstics. Detektions Einschränkungen des Assays erfordern im allgemeinen die Verwendung von höheren Mengen an Enzym als die Farbstoff-Freisetzungsassay. In dieser Studie wurde ein Vergleich der Nachweisgrenzen des Mikroobjektdiffusionstest (Figur 1) zu dem Farbstoff-Freisetzungs – Assay (Figur 4) veranschaulicht , dass der Mikroobjektdiffusionstest eine weniger empfindliche Technik ist als der Farbstoff-Freisetzungsassay ist. Wenn Enzymkonzentration kein Problem ist, kann der Mikrodia Test für schnelle anfängliche Screening von Bibliotheken für die Herstellung von Protein antimikrobielle Wirkstoffe gegen Zielsubstrate mit geringer Arbeit und Ausrüstung verlangt. Obwohl mehr Aufwand und Ausrüstung erfordern, wird das Farbstoff-Freisetzungs-Assay empfindlicher und reproduzierbarer und ergab quantitative Ergebnisse, die einen Vergleich zwischen Farbstofffreisetzungstests der gleichen oder verschiedene Enzyme für ein gegebenes Substrat zu ermöglichen. Die beiden Methoden sind leicht für hoch spezialisierte Instrumentierung, ohne dass in den meisten mikrobiologischen Laboratorien durchgeführt. In der Vertretive Assays, die Steuer Enzym α-Chymotrypsin, wurde bei Mengen so niedrig wie 100 ng (Abbildung 5) unter Verwendung der Farbstofffreisetzungsassay detektiert wird , während die minimale Menge in dem Mikroobjektdiffusionsassay detektiert 1 & mgr; g (Daten nicht gezeigt).
Bereitstellen Brauchbarkeit als qualitative Nachweistest für antimikrobielle Enzyme, wurden eine Reihe von Variationen des Diffusionstest wurden 11,13 gemeldet. Bei der Überprüfung dieser Assays wurde die Mikroobjektdiffusionsassay für seine relativ hohe Empfindlichkeit als Anfangsbild und für seine einfache Reaktions Einhaltung entwickelt. Modifizierte aus der Arbeit von Lachica et al. 11, bei der Agarose – Overlays wurden verwendet , um die Produktion von Nukleasen durch Stämme von Staphylococcus aureus zu erfassen, arbeitet der Mikroobjektdiffusionstest ähnlich zu der radialen Immundiffusionsverfahren 14 , wie das Protein aus dem Bohrloch in das diffundiert Agarose, enthaltend das Substrat. Die radiale immunodiffusion Verfahren hält die Ausdehnung der Zone der Immunpräzipitation, wenn das System eine komplexe Bildung Gleichgewicht zwischen dem diffundierenden Antigen und Antikörper in der Agarose erreicht. Im Gegensatz dazu ist das Substrat des Mikroobjektdiffusionsassay anfänglich durch die diffundierende Protein antimikrobielles in einer ständig wachsenden Zone der Lyse umgebenden gut verdaut. Der zunehmende Durchmesser der Zone fortgesetzt, bis die Enzymaktivität oder das Substrat verliert erschöpft ist. Die Rate der Erzeugung der Zone der Lyse wird als die Reinheit beschleunigt und damit die spezifische Aktivität des Enzyms oder der Konzentration des Enzyms zu den gut zunimmt zugegeben.
Für die enzymatische Aktivität von Protein antimikrobielle Mittel gegen Hitze abgetöteten B. quantitativ beurteilen subtilis, wobei das Farbstoff-Freisetzungsassay wurde ausgewählt. Kolorimetrische Assays Remazol Farbstoff Brillantblau R (RBB) mit -markierten Substraten vielseitig und sensibel Bewertung von Protein antimikrobiellen activi erlaubenty. Enzymatische Hydrolyse von RBB-markiertes Substrat führt zur Freisetzung von löslichen blauen Produkte, die leicht durch ein Spektrophotometer bei 595 nm gemessen werden kann. Mehrere Variationen des RBB Farbstoff-Freisetzungstest, andere Protein antimikrobielle Enzyme zur Charakterisierung entwickelt, zeigen die Flexibilität dieses Tests für die Anwendung mit anderen Substraten. Zum Beispiel, um die Auswirkungen von Lysostaphin bakteriolytisch Aktivität bei der Bestimmung, Zhou et al., Berichtet ein Farbstoff-Freisetzungstest RBB-gefärbten Staphylokokken – Zellen und Staphylokokken peptidoglycan als Substrate 12 verwendet wird . In einer Abwandlung der Anwendung dieses RBB Farbstoff-Freisetzungstest, Micrococcus-RBB markierte luteus Substrat wurde für die Verwendung als schnelle und empfindliche Mittel vorgeschlagen zu diagnostizieren und Bildschirm für Krankheiten wie bakterielle Infektion und das Vorhandensein eines bösartigen Karzinom, dem die menschliche Lysozym – Expressionsniveaus im Blutserum 15 korreliert werden. Darüber hinaus RBB-markierte Bakterienzellsubstrate haben eineLSO wurde in einem Zymogramm Verfahren zum Nachweis von Lysozym 16 verwendet.
Wir zeigen die Nachweisgrenze gesenkt, Bequemlichkeit und Reproduzierbarkeit des Farbstoff-Freisetzungstest, so dass für eine schnelle Bibliothek-Screening für die Enzymproduktion. Modifikationen des Assays ermöglichen nachgeschalteten quantitative biochemische Charakterisierung Assays, einschließlich der Auswirkungen von Temperatur, pH und Salzgehalt , sowie die Auswirkungen anderer proteolytischer Enzyme auf die Aktivität von antimikrobiellen Proteinen 6. Darüber hinaus kann die quantitative Farbstofffreisetzungsassay verwendet werden, die Aktivitäten mehrerer Enzyme, die für ein gegebenes Substrat zu vergleichen. Der RBB Farbstoff-Freisetzungstest wurde auf die Charakterisierung und Nachweis von Protein antimikrobielle Mittel zusätzlich Dienstprogramm für Enzyme mit Aktivität gegen Polysaccharide berichtet. Pettersson und Eriksson berichtet einen Test zum Nachweis von Endoglycanase Aktivität unter Verwendung von amorphen, RBB-gefärbten Polysaccharidkügelchen aus Cellulose, Xylan, Mannan und Chitin 17. In einer Erweiterung dieser Feststellungen, ein empfindliches Verfahren zum Nachweis von Chitinase von Bacillus thuringiensis Bt-107 produzierten Enzyme wurde 18 unter Verwendung von kolloidalem Chitin , markiert mit RBB entwickelt. Aus diesen und anderen Studien, im Handel erhältliche Quellen von RBB-gefärbten Substrate wurden für die Verwendung beim Nachweis von glykolytischen Aktivität, einschließlich solcher gegen Keratin, Amylopektin, Amylose, Glycogen, Laminarin, D-Xylan, Azo-barley Glucan und Stärke entstanden.
In dieser Studie zeigen wir die Nützlichkeit des Farbstoff-Freisetzungs-Assay in einem Mikroplattenformat, das Volumen des RBB-markiertem Substrat und Enzym erforderlich ist, reduziert die kolorimetrische Ergebnis zu erzeugen. Wie in 4 veranschaulicht und Figur 5 stellt die Mikrotiterplatte Farbstofffreisetzungsassay eine untere Nachweisgrenze als die Mikroobjektdiffusionsassay für die enzymatische Aktivitätserkennung. Im Hinblick auf den schnellen Einsatz, die Erhaltung der Arbeit und der Leichtigkeit der Interpretation, die microslide Diffusionsassay liefert Dienstprogramm in anfänglichen Hochdurchsatz-Screens für die Anwesenheit antimikrobieller Aktivität sowie die Angabe des antimikrobiellen Proteins in Anwesenheit nachgeschalteten Protein Isolierungs- und Reinigungsschritte. Die Kombination dieser beiden Assays ergänzen sich in der ersten Screening und ultimative Charakterisierung neuartiger Protein antimikrobielle Wirkstoffe
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
cork borer | Humboldt | H-9661 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution | |||
agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
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250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
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200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |