Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
O ensaio de difusão MicroSlide e no ensaio de corante-release fornecem vantagens para detectar e caracterizar antimicrobianos proteínas não identificadas anteriormente. Estes métodos rápidos e sensíveis permitir o rastreio de alto rendimento de bibliotecas de código do organismo para a identificação de enzimas de interesse antes de investir maiores recursos de pesquisa. Como enzimas alvo de alto nível são identificados, variações dos ensaios de detecção pode ser usado para detectar rapidamente a enzima ou para determinar as características bioquímicas da enzima. Por exemplo, durante um regime de vários passos de purificação de proteína, o ensaio de difusão microlâmina pode detectar rapidamente fracções que continham a enzima de interesse. Além disso, optima de reacção para a enzima pode ser determinada alterando os tampões de reacção e temperaturas de incubação no ensaio de libertação de corante.
O intervalo de massa enzima necessária para a detecção no ensaio de difusão microlâmina é uma função da enzima caracteristics. limitações de detecção do ensaio geralmente requerem a utilização de maiores quantidades de enzima do que o ensaio de corante de libertação. Neste estudo, a comparação dos limites de detecção do ensaio de difusão microlâmina (Figura 1) para o ensaio de corante de libertação (Figura 4) ilustrou que o ensaio de difusão microlâmina é uma técnica menos sensível do que o ensaio de corante de libertação. Quando a concentração de enzima não é uma preocupação, o ensaio MicroSlide permite a triagem inicial rápida de bibliotecas para a produção de proteínas antimicrobianos contra substratos alvo com baixas exigências de trabalho e de equipamento. Embora exigindo mais esforço e equipamento, o ensaio de corante de libertação é mais sensível e reprodutível, obtendo-se resultados quantitativos que permitem a comparação entre ensaios de corante de libertação do mesmo ou de diferentes enzimas para um determinado substrato. Os dois métodos são facilmente realizados na maioria dos laboratórios microbiológicos sem necessidade de instrumentação altamente especializado. Na representaçãoensaios tivas, a enzima de controlo, α-quimotripsina, foi detectada em quantidades tão baixas quanto 100 ng (Figura 5) utilizando o ensaio de corante de libertação, enquanto o valor mínimo detectado no ensaio de difusão microlâmina foi de 1 mg (dados não mostrados).
Fornecendo utilidade como um ensaio para a detecção qualitativa enzimas antimicrobianos, um número de variações do ensaio de difusão foram relatados 11,13. Ao rever estes ensaios, o ensaio de difusão MicroSlide foi desenvolvido para sua relativamente alta sensibilidade como uma tela inicial e por sua facilidade de observância reação. Modificado a partir do trabalho de Lachica et al. 11, na qual camadas de agarose foram usadas para detectar a produção de nucleases por estirpes de Staphylococcus aureus, o ensaio de difusão MicroSlide opera de forma semelhante ao método de imunodifusão radial 14 como a proteína difunde-se a partir do bem para a de agarose contendo o substrato. O immunodiffu radialmétodo sion interrompe a expansão da zona de imunoprecipitação quando o sistema atinge um equilíbrio de formação de complexo entre o antigénio e o anticorpo de difusão dentro da agarose. Em contraste, o substrato no ensaio de difusão microlâmina é inicialmente digerido pela proteína antimicrobiana de difusão numa zona em contínua expansão de lise em torno do poço. O diâmetro crescente da zona continua até que a enzima perde actividade ou o substrato é esgotado. A taxa de produção da zona de lise é acelerado como a pureza, e, assim, a actividade específica, da enzima ou a concentração da enzima adicionada ao poço aumenta.
Para avaliar quantitativamente a actividade enzimática da proteína antimicrobianos contra morta pelo calor B. subtilis, foi escolhido o ensaio de corante-release. ensaios colorimétricos utilizando Remazol brilhante corante azul R (RBB) marcado com substratos permitir a avaliação versátil e sensível de proteínas activi antimicrobianaty. A hidrólise enzimática de substrato resultados RBB-rotulados na libertação de produtos solúveis azuis que podem ser facilmente medida por um espectrofotómetro a 595 nm. Diversas variações do ensaio de libertação de corante RBB, desenvolvidas para caracterizar outras proteínas, enzimas antimicrobianos mostrar a flexibilidade deste ensaio para aplicação com outros substratos. Por exemplo, para determinar os efeitos da actividade de lisostafina bacteriolíticos, Zhou, et al., Relataram um ensaio de corante de libertação utilizando células de estafilococos RBB-tingido e estafilococos peptidoglicano como substratos 12. Numa modificação da aplicação do presente ensaio de corante de libertação RBB, RBB-rotulados substrato Micrococcus luteus foi proposto para utilização como um meio rápido e sensível para o diagnóstico e a tela para as doenças tais como a infecção bacteriana e a presença de um carcinoma maligno, que pode ser correlacionada com os níveis de expressão de lisozima em soro de sangue humano 15. Além disso, os substratos de células bacterianas RBB-marcados ter umalso sido utilizada num método para a detecção zimograma de lisozima 16.
Demonstramos o limite de detecção reduzido, conveniência, e a reprodutibilidade do ensaio de corante de libertação, permitindo a rápida rastreio da biblioteca para a produção da enzima. As modificações do ensaio permitir para ensaios de caracterização jusante quantitativos bioquímicos, incluindo efeitos da temperatura, pH, salinidade e, bem como os efeitos de outras enzimas proteolíticas sobre a actividade de proteínas antimicrobianas 6. Além disso, o ensaio de corante de libertação quantitativa pode ser utilizado para comparar as actividades de várias enzimas para um determinado substrato. O ensaio de libertação de corante RBB relatou utilidade para enzimas com actividade contra polissacáridos em adição à caracterização e a detecção de agentes antimicrobianos de proteína. Pettersson e Eriksson relatado um ensaio para detectar a actividade endoglicanase usando amorfos, grânulos de polissacarídeos RBB-tingidos de celulose, xilana, manana, e bilheteem 17. Em uma expansão destes resultados, um método sensível para detecção de enzimas quitinase produzidos por Bacillus thuringiensis Bt-107 foi desenvolvido utilizando quitina coloidal marcado com RBB 18. A partir destes e outros estudos, as fontes disponíveis comercialmente de substratos tingidos RBB-surgiram para utilização na detecção da actividade glicolítica, incluindo aquelas contra a queratina, amilopectina, amilose, glicogénio, laminarina, d-xilano, Azo-glucano de cevada, e amido.
Neste estudo, que demonstram a utilidade do ensaio de corante de libertação em um formato de microplacas, reduzindo o volume de substrato de RBB-marcados e enzima requerida para produzir o resultado colorimétrico. Tal como ilustrado na Figura 4 e na Figura 5, o ensaio de corante de libertação de microplacas proporciona um limite de detecção inferior do que o ensaio de difusão microlâmina para a detecção de actividade enzimática. No que diz respeito ao uso rápido, conservação do trabalho, e facilidade de interpretação, o micensaio de difusão roslide fornece utilidade em telas de alto rendimento iniciais para a presença de actividade antimicrobiana, bem como a indicação da presença de proteína antimicrobiana nos passos de isolamento e purificação de proteínas a jusante. A combinação destes dois ensaios complementam um ao outro na triagem inicial e final caracterização de novos agentes antimicrobianos proteínas
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
cork borer | Humboldt | H-9661 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solution | |||
agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
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250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
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200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |