Visualização de Twitching motilidade e Caracterização do papel da<em> PilG</em> in<em> Xylella fastidiosa</em
Summary
Neste estudo, uma câmara de fluxo nano-microfluídico foi utilizado para visualizar e funcionalmente caracterizar a motilidade espasmos da Xylella fastidiosa, bactéria que causa a doença de Pierce em videira.
Abstract
Xylella fastidiosa é uma bactéria não-flagelado Gram negativo que causa uma série de doenças economicamente importantes de plantas. A motilidade espasmos fornece X. fastidiosa um meio para o movimento de longa distância intra-planta ea colonização, contribuindo para patogenicidade em X. fastidiosa. A motilidade espasmos de X. fastidiosa é operado por pili tipo IV. Pili de tipo IV de Xylella fastidiosa são regulados por pilG, um regulador de quimiotaxia em proteínas do operão de codificação Pil-CHP que estão envolvidos com vias de transdução de sinal. Para elucidar os papéis de pilG na motilidade espasmos de X. fastidiosa, uma pilG -deficient mutante Xf ΔpilG e sua estirpe complementar XfΔpilG- C contendo pilG nativa foram desenvolvidos. A câmara microfluídicos integrados com um sistema de gravação de imagens de lapso de tempo foi usado para observar espasmos motilidade em XfΔpIlg, XfΔpilG- C e sua linhagem selvagem. Usando este sistema de gravação, que permite observações espaciais e temporais de longa duração de agregação, a migração de células individuais e as populações de bactérias através de motilidade espasmos X.. fastidiosa tipo selvagem e complementar estirpe XfΔpilG- C mostrou características típicas espasmos motilidade diretamente observados nas câmaras de fluxo microfluídicos, enquanto mutante XfΔpliG exibiu o fenótipo deficiente se contraindo. Este estudo demonstra que pilG contribui para a motilidade espasmos dos X. fastidiosa. A câmara de fluxo microfluidico é utilizado como um meio para a observação de contracções motilidade.
Introduction
Xylella fastidiosa é uma bactéria patogénica gram-negativas não flagelados, que faz com que um certo número de doenças de culturas economicamente importantes, incluindo a doença de Pierce em videira (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Esta bactéria é limitada ao xilema de condução de água embarcações. Infecção da videira faz com que o bloqueio dos vasos do xilema e resulta em estresse hídrico e deficiências nutricionais 3. Colonização bem sucedida depende da capacidade da bactéria para se mover a partir do local inicial da infecção para o resto da planta 3. Espasmos motilidade é um meio de movimento bacteriana independente de flagelar através da extensão, apego e retração do pili tipo IV polar 4 que tem sido caracterizado X. fastidiosa 5,6,7.
A motilidade espasmos tem sido observado por pinças laser e microscopia de força atômica (AFM) 8,9,10. Utilizando estas técnicas, tmotilidades witching gerado pelo pilus de tipo IV de N. gonorrhoeae e P. aeruginosa foram caracterizados por fl pili rotulagem uorescently e capturando os seus movimentos microscopicamente. Embora ambos os métodos tenham detalhado a força adesiva de bactérias individuais, os procedimentos são complicados e demorados 9,10. As câmaras uidic fl micro foram usados para observar a migração de longa distância de células individuais, bem como pequenos agregados de células bacterianas 5,6. Estas câmaras foram concebidas como um-nano-canal microfabricated em uma placa integrada com um lapso de tempo 11,12,13,14 sistema de gravação de imagem. Micro fl dispositivos câmara uidic oferecem várias vantagens para estudar o comportamento movimento e célula-célula interações de bactérias: (i) fornece uma plataforma integrada com múltiplas capacidades de canal; (Ii) que pode examinar os movimentos e agregações de células individuais nas características de nano-escala de bactérias; (Iii) que permite m diretaicroscopic gravação de imagem de células bacterianas e análises de lapso de tempo, (iv) ele fornece observações espaciais e temporais de longo prazo de populações individuais e / ou de bactérias em um micro-ambiente; (V) a taxa de fluxo de meio de cultura em um canal pode ser controlada com precisão e (VI), apenas um muito pequeno volume (1 ml) de meio de cultura é necessário para cada experiência.
Recentemente, o micro fl uidic fluxo do sistema foi utilizado para investigar o comportamento de células bacterianas sob diferentes microambientes 14,15,16. A adesividade e o anexo de superfície do E. coli 15, X. fastidiosa 16 e Acidovorax citrulli 14 em superfícies de vidro foram avaliados através de câmaras uidic micro fl. A formação de agregação e biofilme mediada por tipo pili IV do Acidovorax citrulli foram analisados 14. Além disso, o movimento de A. citrulli observado sob fl uxo cs condições demonstraram que o pili de tipo IV podem desempenhar papéis importantes na colonização e a propagação de A. citrulli nos vasos do xilema sob seiva fluxo condições. Os motilidades espasmos de Pseudomonas aeruginosa e X. fastidiosa células foram observadas com sucesso contra uma corrente de fluido numa câmara de fluxo microfabricado 5,6,17. Pilus de tipo IV deficiente PilB e pilQ mutantes de X. fastidiosa foram encontrados para alterar profundamente a velocidade da contraindo motilidade nas condições fl uxo em micro dispositivos uidic fl 5,6,18. Os estudos realizados sobre a adesão bacteriana e motilidade em dispositivos uidic fl micro indicaram que as câmaras uidic micro fl são particularmente adequadas para analisar a motilidade contrair-se e a migração das bactérias mediada por pili in vitro. Estes resultados explicam o mecanismo de migração mediada por espasmos que facilita a ligação célula-célula, a agregação e a colonização dentroo anfitrião, eventualmente, levar a infecção sistémica.
Pil-Chp operon de X. fastidiosa contém pilG, Pili, pilJ, Comprimido, CHPB e CHPC que a transdução do sinal de codificação vias 20. Os quimiorreceptores transmembranares ligar estímulos químicos no domínio periplasmático e activar uma cascata de sinalização na sua porção citoplasmática para controlar, em última análise da motilidade espasmos bacteriana. No operão Pil-cogeração de X. fastidiosa, uma PilG proteína fosfo-shuttle é um homólogo de CheY. Em E. coli e P. aeruginosa, CheY é o regulador de resposta de quimiotaxia em sistemas que interagem com as proteínas do motor flagelos 19, 21. Embora as contribuições do operon Pil-Chp em direção a virulência em X. fastidiosa foram examinados 20 recentemente, o papel de pilG no operão quimiotaxia em resposta aos sinais ambientais e regulada pili de tipo IV / motor de X. fastidiosa é UNClear. Para elucidar a visão do regulador de quimiotaxia pilG na actividade da motilidade espasmos de X. fastidiosa, uma câmara de micro uidic FL é utilizado para avaliar a motilidade espasmos dos X. fastidiosa. O pilG de X. fastidiosa é caracterizada pela comparação dos fenótipos de um mutante de deleção Xf ΔpliG, a estirpe complementar XfΔpliG -C e seu tipo selvagem in vitro. Os resultados destacam o papel de pilG na motilidade espasmos de X. fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, caracteriza o comportamento de movimento de X. fastidiosa PilG mutante Xf ΔpilG e suas complementares estirpes XfΔpilG- C em recém-projetado de múltipla nano-canal paralelo micro câmaras fl uidic. As câmaras uidic recém-projetado micro fl pode ter até quatro câmaras paralelas com 100 um nano-canal de largura em comparação com modelos anteriores, com apenas uma única de 50 m de largura do canal 18. A melhoria mais ampla nano-canal facilita …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação são mencionados somente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica qualquer recomendação ou conselho pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos. O USDA é um fornecedor de oportunidades iguais e empregador.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
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