의 역할의 꿈틀 운동성의 시각화 및 특성<em> PilG</em>에서<em> Xylella의 fastidiosa</em
Summary
본 연구에서는 나노 미세 유체 흐름 챔버는 시각화 기능 Xylella fastidiosa, 포도 나무에 피어스의 질병을 일으키는 세균의 꿈틀 운동의 특성을 사용 하였다.
Abstract
Xylella fastidiosa의 식물의 경제적으로 중요한 질환들을 유발하는 그람 – 음성 박테리아 이외 flagellated이다. 꿈틀 운동성은 X를 제공합니다 fastidiosa 장거리 내 공장 이동 및 정착을위한 수단이 X에서 병원성으로 기여 X의 fastidiosa. 꿈틀 운동 fastidiosa는 타입 IV의 필리 운영하고 있습니다. Xylella의 fastidiosa의 유형 IV의 필리는 pilG, 신호 전달 경로에 관여하는 필-순찰대 오페론 인코딩 단백질의 화성 조절기에 의해 조절된다. X의 꿈틀 운동에 pilG의 역할을 규명하려면 fastidiosa하는 pilG 결핍 돌연변이 Xf를 ΔpilG 및 기본 pilG을 포함하는 그것의 보완 변형 XfΔpilG- C가 개발되었다. 타임 랩스 영상 녹화 시스템과 통합 마이크로 유체 챔버 XfΔp 경련 운동성을 관찰하는 데 사용ILG, XfΔpilG- C와 야생형 균주. 이 기록 장치를 사용하여, 장기 시공간 응집 관측 각 셀 및 경련 운동성 통해 박테리아 집단의 이동을 허용한다. X. 돌연변이 XfΔpliG는 연축 결핍 표현형을 나타내 fastidiosa 반면 야생형과 상보 XfΔpilG- C 균주 직접 미세 유동 챔버 관찰 전형적인 경련 운동성 특성을 보였다. 이 연구는 pilG는 X의 꿈틀 운동성에 기여하고 있음을 보여줍니다 fastidiosa. 마이크로 유체 유동 챔버 경련 운동성을 관찰하는 수단으로 사용된다.
Introduction
Xylella의 fastidiosa가 포도에서 피어스 질환 (비 티스 VINIFERA L.) 1, 2, 3을 포함하여 경제적으로 중요한 작물 질환들을 유발하는 그람 – 음성 비 flagellated 병원성 박테리아이다. 이는 박테리아 물 전도성 목부에 한한다 선박. 소문의 감염은 목부의 선박과 물 부족의 결과와 영양 결핍 (3)의 막힘이 발생합니다. 성공적인 정착 식물 (3)의 나머지 감염의 초기 위치에서 이동하는 박테리아의 능력에 달려있다. X. 특징으로 한 극성 타입 IV의 필리 (4)의 연장, 첨부 한 후퇴 통해 편모 독립적 박테리아 이동 수단이되어 운동성 경련 fastidiosa 5,6,7.
경련 운동성 레이저 핀셋 및 원자 힘 현미경 (AFM) 8,9,10에 의해 관찰되었다. 이러한 기술을 이용하여 t매혹적인의 motilities는 N.의 유형 IV의 pilus에 의해 생성 임질과 P. 녹농균은 플로리다 uorescently 라벨 필리 현미경으로 그들의 움직임을 포착 특징으로했다. 두 방법은 개별 박테리아의 접착력 상술되었지만, 절차는 복잡하고 시간 소모적 9,10이다. 마이크로 FL uidic 챔버 장거리 개별 셀의 이동뿐만 아니라 박테리아 세포 5,6- 작은 응집체를 관찰 하였다. 이 챔버는 시간 경과 영상 녹화 시스템 11,12,13,14 통합 접시에 미세 나노 채널로 설계되었다. 마이크로 uidic 챔버 장치 박테리아의 이동 동작 및 세포 – 세포 상호 작용을 연구 몇 가지 장점을 제공 FL : (ⅰ)는 다중 채널 기능이 통합 된 플랫폼을 제공한다; (ⅱ)는 모션 및 박테리아의 나노 크기 특성의 단셀의 집합체를 검사 할 수있다; (ⅲ)이 직접 m 가능박테리아 세포 및 시간 경과 분석 icroscopic 영상 기록은, (ⅳ)는 마이크로 환경에서 박테리아의 개인 및 / 또는 인구의 장기 공간 및 시간 관찰을 제공한다 (V) 채널에서 배양액의 유량을 정확하게 제어 할 수 있으며, 배양액 (VI)의 매우 작은 양 (1 ml)을 각각의 실험에 대해 요구된다.
최근 마이크로 FL uidic FL 흐름 시스템은 다양한 미세 환경 14,15,16에서 박테리아 세포의 행동을 조사하기 위해 사용되어왔다. 접착 및 E.의 표면에 부착 대장균 (15), X. fastidiosa 16 및 Acidovorax 유리 표면에 14 마이크로 FL uidic 챔버를 이용하여 평가 하였다 citrulli. Acidovorax의 citrulli의 유형 IV의 필리에 의해 매개 집계 및 바이오 Fi를 필름 형성 (14)를 분석 하였다. A.의 또한, 움직임 citrulli는 플로리다 흐름 C 관찰onditions는 타입 IV의 필리가 식민지에서 중요한 역할을 할 수 있음을 입증하고 A.의 확산 수액 FL 흐름 조건에서 목부 선박에 citrulli. 녹농균 및 X의 꿈틀 motilities fastidiosa 세포가 성공적으로 미세 유동 챔버 5,6,17에 유체 전류에 대해 관찰되었다. 타입 IV pilus는 X의 pilB 및 pilQ 돌연변이 결핍 fastidiosa는 깊이 마이크로 FL uidic 장치 5,6,18에서 플로리다 유동 조건에서 운동성을 꿈틀의 속도를 변경하는 것으로 밝혀졌다. 마이크로 FL uidic 장치 세균 부착 및 운동성 실시 연구 마이크로 FL uidic 챔버들은 시험 관내에서 필리 매개 세균의 경련 운동성 및 이동 분석에 특히 적합한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 세포 – 세포 부착, 응집 집락 내를 용이 경련 매개 이동기구를 설명호스트는 결국 전신 감염으로 이어질.
X의 필 – 열병합 오페론 fastidiosa는 인코딩 신호 전달 (20) 경로 pilG, PILI, pilJ, 알약, chpB 및 chpC이 포함되어 있습니다. 횡단 chemoreceptors는 주변 세포질 도메인에 화학적 자극을 결합하여 궁극적으로 세균 꿈틀 운동성을 제어하기 위해 자신의 세포질 부분에 신호 캐스케이드를 활성화합니다. X의 필 – 열병합 오페론에서 fastidiosa하는 포스 포 셔틀 단백질 PilG는 최 회장에 동족체이다. E.에서 대장균 및 P. 녹농균은 최은 편모 단백질 모터 (19), (21)와 상호 작용 화성 시스템에서 응답 레귤레이터이다. X의 독성을 향해 필 – 열병합 오페론의 기여 있지만 fastidiosa는 환경 신호에 응답하고 X의 규제 / 모터 유형 IV의 필리에, 최근에 화성 오페론에 pilG의 역할을 (20)을 조사 하였다 fastidiosa는 UNC입니다리어. X의 꿈틀 운동의 활동에 화성 레귤레이터 pilG의 통찰력을 규명하려면 fastidiosa, 마이크로 FL uidic 챔버는 X의 꿈틀 운동성을 평가하는 데 사용됩니다 fastidiosa. X.의 fastidiosa의 pilG은 삭제 돌연변이 Xf를 ΔpliG, 보완 변형 XfΔpliG -C 및 시험 관내에서의 야생형의 표현형을 비교하는 것을 특징으로한다. 결과는 X의 경련 운동성 pilG의 역할을 강조 fastidiosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는 X의 모션 동작을 특징으로하는 fastidiosa PilG 돌연변이 Xf를 ΔpilG와 새롭게 디자인 된 다수의 병렬 나노 채널 마이크로 FL uidic 챔버에서의 보완 XfΔpilG- C 균주. 새롭게 디자인 된 마이크로 FL uidic 챔버는 하나의 50 μm의 넓은 채널 (18)과 이전 디자인에 비해 폭이 100 μm의 나노 채널과 최대 4 개의 병렬 챔버를 가질 수 있습니다. 개선 된 넓?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 농무부, 농무부 농업 연구소 (Agricultural Research Service)에 의해 지원되었다. 이 책에서 무역 이름 또는 상용 제품은 특정 정보를 제공 할 목적으로 만 언급하고 미국 농무부에 의해 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. USDA는 평등 한 기회 제공 및 고용주입니다.
Materials
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., wt al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
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