Summary

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション<em> PilG</em>で<em> Xylella fastidiosa</em

Published: April 08, 2016
doi:

Summary

本研究では、ナノマイクロ流体フローチャンバーは、視覚化し、機能的にXylella fastidiosa、グレイプバインのピアース病を引き起こす細菌の単収縮運動を特徴づけるために使用しました。

Abstract

Xylellaのfastidiosaは、植物の経済的に重要な多くの疾患の原因となるグラム陰性非鞭 ​​毛細菌です。けいれん運動性は、Xを提供しますXの病原性に寄与する、長距離イントラ植物の動きと植民地化のための手段をfastidiosa fastidiosa。X.のけいれん運動fastidiosaは、IV型線毛によって運営されています。 XylellaのfastidiosaのIV型線毛はpilG、シグナル伝達経路に関与しているピル-Chpのオペロンをコードするタンパク質における走化性の調節因子によって調節されています。 Xの攣縮運動にpilGの役割を解明するために、 fastidiosa、pilG欠損変異体XfΔpilGとネイティブpilGを含むその相補株XfΔpilG-Cを開発しました。タイムラプス画像記録システムと統合マイクロ流体チャンバはXfΔpに痙攣運動を観察するために使用されましたILG、XfΔpilG-Cおよびその野生型株。 この記録システムを使用して、長期の空間的および時間的な凝集の観察結果、個々の細胞および単収縮運動を介して細菌の集団の移動を可能にする。X.変異XfΔpliGがけいれん欠損表現型を示し、一方fastidiosa野生型および相補XfΔpilG-C株は、直接的にマイクロ流体フローチャンバーにおいて観察された典型的な単収縮運動の特性を示しました。この研究は、pilGは Xのけいれん運動性に寄与することを実証していますfastidiosa。マイクロ流体フローチャンバーは、単収縮運動性を観察するための手段として使用されます。

Introduction

Xylellaのfastidiosaはブドウでピアース病を含む、経済的に重要な作物の多数の疾患を引き起こすグラム陰性非鞭 ​​毛、病原性細菌である( ヴィティスヴィニフェラ L.)1,2、3。この細菌は導水木部に限定されています船。ブドウの感染は、水ストレスや栄養不足3における木部船と結果の閉塞を引き起こします。成功植民地化は、植物3の残りの部分に感染の初期のサイトから移動する細菌の能力に依存します。運動性をけいれんすると、鞭毛に依存しない細菌の延長を経て動き、添付ファイル、およびXに特徴付けられている極性IV型線毛4の後退の手段でありますfastidiosa 5,6,7。

単収縮運動性は、レーザーピンセット及び原子間力顕微鏡(AFM)8,9,10により観察されました。これらの技術を用いて、TN.のIV型線毛によって生成された魔術の運動能淋菌およびP.緑膿菌は、FL uorescentlyラベリング線毛と微視的にその動きを捕捉することによって特徴づけられました。両方の方法は、個々の細菌の接着力を詳述しているが、手順が複雑で時間9,10を消費しています。微小流体チャンバは、長距離個 ​​々の細胞の遊走、ならびに細菌細胞5,6の小さな凝集物を観察するために使用しました。これらのチャンバは、タイムラプス画像記録システム11,12,13,14と統合プレートに微細加工・ナノチャンネルとして設計されました。マイクロuidic室デバイスが移動行動や細菌の細胞間相互作用を研究するためのいくつかの利点を提供FL:(ⅰ)それは、複数のチャネル機能を備えた統合プラットフォームを提供します。 (ⅱ)それは細菌のナノスケールの特徴における単一細胞の運動や集計を調べることができます。 (ⅲ)それが直接メートルを可能にしますicroscopic細菌細胞の画像記録とタイムラプス解析、(iv)は、それは微小環境中の細菌の個々のおよび/または集団の長期的、空間的および時間的な観測を提供します。 (V)チャネルにおける培地の流量を正確に制御することができ、(VI)培地の非常に少量(1 ml)を各実験について必要とされます。

最近では、微小流体流動システムは、様々な微小環境14,15,16の下で細菌細胞の挙動を調査するために採用されています。接着性およびE.の表面付着大腸菌 15、X. fastidiosa 16、およびアシドボラックスは、ガラス表面への14の微小流体チャンバーを用いて評価したcitrulli。 アシドボラックスcitrulliのIV型線毛によって媒介凝集し、バイオフィルムの形成は、14を分析しました。 A.のさらに、運動流Cの下で観察citrullionditionsは、IV型線毛は、Aの植民地化と普及に重要な役割を果たしていることを実証しました樹液流条件下での木部船でcitrulli。 緑膿菌およびXのけいれんの運動能fastidiosa細胞が正常に微細加工フローチャンバー5,6,17内の流体流れに逆らって観察しました。 IV型線毛は、XpilBpilQ変異体を欠損しましたfastidiosaは深く微小流体デバイス5,6,18における流動条件でけいれん運動の速度を変更することが見出されました。微小流体デバイスにおける細菌の接着および運動性について行った研究は、微小流体チャンバが、インビトロで線毛媒介細菌の単収縮運動性および遊走を分析するのに特に適していることが示されました。これらの結果は、内の細胞 – 細胞付着、凝集・定着を促進するけいれん媒介移行メカニズムを説明しますホストは、最終的には全身感染につながります。

XのPIL-のCHPオペロンfastidiosaは、エンコード信号の伝達が20を経路pilG、線毛、pilJ、ピル、chpBchpCが含まれます 。膜貫通化学受容体は、ペリプラズムドメイン内の化学的刺激を結合して、最終的には細菌のけいれんの運動性を制御するために、それらの細胞質部分のシグナル伝達カスケードを活性化します。 Xのピル-のCHPオペロン中fastidiosa、ホスホシャトルタンパク質PilGはチェイに相同体です。 E.coliおよびP.緑膿菌、崔はべん毛モータータンパク質19、21と相互作用する走化性システムのレスポンスレギュレーターです。 Xの病原性に向けてピル-のCHPオペロンの貢献が、 fastidiosaは 、最近20の環境シグナルへとX.の規制/モータIV型線毛に応答した走化性オペロン中pilGの役割を調べましたfastidiosaは、UNCでありますリア。 Xの攣縮運動の活動に走化性レギュレータpilGの洞察を解明するために、 fastidiosa、微小流体チャンバーはXのけいれんの運動性を評価するために使用されますfastidiosa。 X.のfastidiosaのpilGは、 欠失変異体 XfΔpliG、補完的な歪みXfΔpliG-Cおよびin vitroでその野生型の表現型を比較することを特徴としています。結果は、Xのけいれん運動中pilGの役割を強調表示しますfastidiosa。

Protocol

1.細菌コロニーの周辺フリンジ Xを育てます28℃でfastidiosa( のXf)テメキュラ野生型22、pilG欠失変異体のXfΔpliG(前述削除戦略23を使用)、およびその相補XfΔpliG-C(以前染色体ベースの遺伝的相補戦略24を用いて説明した)PD2培地寒天プレート上で25 5-7日のために、C。 15分間121°C(249°F)で水にオ?…

Representative Results

IV型線毛によって媒介される単収縮運動を示す周辺コロニー縞の存在は、Xのコロニーが観察されましたfastidiosa野生型および相補性のXfΔpliG-C株( 図1)。ミュータントXfΔpliGは 、しかし、コロニーの周囲( 図1)の周りにフリンジを示しませんでした。ナノマイクロ流体フローチャンバー内の細菌細胞のタイ?…

Discussion

本研究では、Xの動きの挙動を特徴付けfastidiosa PilG変異体XfΔpilGと新たに設計された複数の並列-ナノチャネル微小流体チャンバ内のその相補XfΔpilG-C株。新たに設計された微小流体室は、単一の50μm幅のチャネル18と以前の設計に比べて幅が100μmのナノチャネルと最大4つの並列チャンバを持つことができます。改善され、より広いナノチャネル?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、米国農務省、農業研究サービスによってサポートされていました。この資料に記載の商品名や商用製品は、特定の情報を提供する目的のためだけに記載されていると、米国農務省による推薦または保証を意味するものではありません。 USDAは機会均等プロバイダーおよび雇用主です。

Materials

Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type Costa, H. S., et al., 2004 22
pilG deletion mutant XfΔpliG Shi, X. Y., et al., 2007 26
pilG complementary strain XfΔpliG-C  Davis, M. J., wt al. 1998 23
Physical materials and equipment
Disposable inoculating loops VWR international, Radnor, PA #22-363-607 quantitative procedures such as bacterial collection
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation #0002709226 Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits
AmScope MD2000 digital camera AmScope, Irvine, CA SE305R-AZ-E Image, video recording and measurement 
Tubes line Edgewood, NY #T4300 Connected to the syringe and microfluidic chamber
Plastic luer connectors Edgewood, NY Connected to the syringe and microfluidic chamber
Syringe pumps Pico Plus, Harvard Apparatus, MA #702209 The flow rate can be adjusted while the pump is running.
Syringes Gastight, Hemilton Company, Reno, NV #1005 Provide the flowing broth
Inverted Olympus IMT-2 microscope Olympus IMT-2 FLuoro PHase Image observation and recording
SPOT-RT digital camera Diagnostic Instruments, Inc., MI RT230 Image, video recording and measurement
Microscope Shutter The UNIBLITZ, US #LS2T2 Control camera’s exposure time
Microscope Shutter Control system The UNIBLITZ, US VCM-D1 VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver
MetaMorph Image software Universal Imaging Corp., PA Real-time super-resolution image processing 

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Cite This Article
Shi, X., Lin, H. Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa. J. Vis. Exp. (110), e53816, doi:10.3791/53816 (2016).

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