Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.
ictus ischemico avvia una robusta risposta infiammatoria che inizia nel compartimento intravascolare e comporta una rapida attivazione delle cellule residenti cerebrale. Un meccanismo chiave di questa risposta infiammatoria è la migrazione delle cellule immunitarie circolanti al cervello ischemico agevolata dal rilascio chemochine e una maggiore espressione di molecole di adesione endoteliale. leucociti cervello-invadendo sono ben noti, contribuendo alla fase iniziale danno ischemico secondario, ma il loro significato per la cessazione di infiammazione e la riparazione del cervello in seguito è stato recentemente notato solo.
Qui, è previsto un semplice protocollo per l'isolamento efficace delle cellule immunitarie dal cervello ischemico mouse. Dopo la perfusione transcardial, gli emisferi cerebrali sono sezionati e dissociate meccanicamente. digestione enzimatica con Liberase segue gradiente di densità (ad esempio Percoll) centrifugazione per rimuovere mielina e detriti cellulari. Uno dei principali vantaggi di questo protocollo is la procedura gradiente di densità monostrato che non richiede preparazione tempo di gradienti e può essere eseguita in modo affidabile. L'approccio produce conta di cellule altamente riproducibili per l'emisfero del cervello e consente di misurare più pannelli citometria a flusso in una sola replica biologica. La caratterizzazione fenotipica e quantificazione dei leucociti cervello dopo l'ictus che invade sperimentale possono contribuire ad una migliore comprensione dei loro ruoli molteplici in danno e riparazione ischemico.
ictus cerebrale innesca una risposta infiammatoria sostenuta che inizia rapidamente dopo la cessazione del flusso ematico locale e coinvolge praticamente tutte le parti del sistema immunitario. Una importante caratteristica di questa risposta infiammatoria è un afflusso temporizzato di cellule immunitarie al cervello che è guidato da l'attivazione delle cellule endoteliali cerebrali, sostanziale la secrezione di chemochine e aumentato efflusso simpatica 1-3. Infiltrazione di cellule infiammatorie è stato precedentemente considerato deleterio in ictus ischemico, tuttavia, diversi studi di trattamento progettati per bloccare indiscriminatamente leucociti uscita al cervello non sono riusciti a indurre un misurabile beneficio clinico 4. Più recentemente, è diventato evidente che le cellule derivate da monociti inizialmente coinvolti nella progressione del danno ischemico 5 potrebbe anche svolgere un ruolo centrale per la risoluzione dell'infiammazione e successiva riparazione dei tessuti 6.
Grazie all'individuazione di fenotipica e functil'eterogeneità onale tra monociti e macrofagi, le conoscenze sul ruolo dei fagociti mononucleari nello sviluppo e nella risoluzione di infiammazione si è notevolmente ampliato. Nei topi, monociti circolanti possono essere classificati in almeno due sottoinsiemi funzionalmente distinte secondo la loro espressione di superficie di linfociti antigene 6 complesso (Ly-6C) 7. Mentre Ly-6C elevati monocytes''inflammatory erano chiaramente dimostrato di essere essenziale per il controllo delle infezioni batteriche 8, il loro ruolo lesioni sterile è più controverso. In ictus ischemico, l'ablazione selettiva di CCR2 + Ly-6C alto monociti provocato emorragica infarto trasformazione 6. Tuttavia, lo stesso approccio sperimentale ha migliorato la disabilità acuta dopo emorragia intracerebrale 9. Allo stesso modo, diversi sottoinsiemi di cellule T si ritiene di esercitare sia azioni lesive 10 o di protezione 11 in danno cerebrale ischemico, tuttavia, i dati sono controversiAl 12,13 e merita ulteriori indagini. Data questa complessità crescente, diventa chiaro che la conoscenza più approfondita sui ruoli delle diverse cellule immunitarie nel danno e riparazione ischemico è cruciale per tradurre i risultati sperimentali in terapie di targeting infiammazione dopo l'ictus.
Oggi, il più potente strumento per analizzare le risposte immunitarie cellulari è policromatica citometria a flusso. Esso consente l'identificazione e la quantificazione dei vari sottogruppi di cellule immunitarie nel sito di infiammazione, senza la necessità di polarizzare il sistema di etichettatura in vivo o manipolazione genetica 14. Colorazione simultanea di marcatori di superficie delle cellule con anticorpi contro citochine intracellulari 15 o fattori di trascrizione 16 fornisce inoltre informazioni sullo stato funzionale delle singole cellule, fenotipicamente identificati. Come un grave inconveniente, sospensioni di cellule singole sono necessari per le analisi di citometria a flusso, e quindi le informazioni sulla loclizzazione di infiltrati cellulari viene perso. Tuttavia, mentre l'istologia è ideale per ottenere informazioni spaziali, è limitato dal numero di anticorpi che possono essere utilizzati in una sola volta per caratterizzare i sottotipi di cellule immunitarie in un particolare tessuto. Oggi, è necessaria una combinazione di presenza e assenza di vari marcatori di superficie per individuare con certezza rare sottopopolazioni di cellule immunitarie, specialmente le popolazioni di cellule derivate da monociti distinti durante l'infiammazione 17.
Qui, descriviamo un protocollo efficace per isolare un alto numero di leucociti nel cervello postischemico mouse utilizzando una semplice gradiente di densità a singolo strato. Le sospensioni cellulari ottenute possono essere sia analizzati dal flusso multidimensionale citometria o essere ulteriormente arricchita da ordinamento citometria a flusso o la selezione immunomagnetica per eseguire analisi a valle altamente specifici. Il metodo di perfusione dettagli transcardial, la rimozione degli emisferi cerebrali, la dissociazione di tessuto cerebrale in un'unica cella suspensioni, la densità centrifugazione in gradiente per la rimozione della mielina, nonché colorazione degli anticorpi per l'analisi di citometria di flusso.
Qui, si descrive un metodo semplice ed efficace per l'isolamento dei leucociti dal cervello murino dopo ictus sperimentale. L'approccio produce in modo affidabile la conta delle cellule altamente riproducibili per l'emisfero cerebrale che permette di misurare diversi pannelli di flusso in una sola replica biologica.
Apparentemente, una rimozione incompleta del sangue, comprese cellule immunitarie si tradurrà in una visione distorta sulla quantità effettiva di cellule infiammatorie che entrò cerebrale ischemico. Così, quando si utilizza questo protocollo prestare particolare attenzione ad una accurata perfusione transcardial per evitare la contaminazione delle cellule immunitarie infiltrate con non-infiammatorie leucociti circolanti. Per esperienza, l'uso di aghi smussati per la perforazione ventricolo sinistro riduce il rischio di lesioni del setto interventricolare che bypassare perfusione della circolazione sistemica. L'emergere di liquido di perfusione dalle narici è un segno che la perfusione pressureis troppo alta, quindi unaportate nulli> 10 ml / min. Pallido al colore bianco del tessuto cerebrale indica una buona perfusione mentre il colore rosa è un segno di scarsa perfusione.
Un altro passaggio fondamentale di questo protocollo è efficiente dissociazione del tessuto cerebrale che comprende la frammentazione meccanica così come la digestione enzimatica. Tritare il tessuto attraverso il filtro delle cellule è fondamentale per fornire una migliore efficacia della proteasi. Tuttavia, quando omogeneizzare il tessuto, evitare una pressione eccessiva come fagociti mononucleari sono altamente suscettibili di autolisi 22. Per la digestione enzimatica Liberase TL è raccomandato che è una miscela di altamente purificata collagenasi I e II che contiene basse concentrazioni di termolisina proteasi neutra. Il confronto diretto con i protocolli di isolamento precedentemente descritti 14,22,23 rivelati significativamente più alto recupero di cellule vitali per il trattamento Liberase TL (KM dati non pubblicati). Rispetto alla collagenasi che è utilizzare spessod per l'isolamento delle cellule immunitarie dal cervello, Liberase TL contiene livelli trascurabili di endotossine. Questo è di particolare importanza se le cellule sono ordinati per l'analisi a valle a causa elevati livelli di endotossine potrebbe cambiare lo stato di attivazione delle cellule immunitarie 24 e gravemente compromettere la coltura cellulare esiti 25. Un altro inconveniente di collagenasi tradizionale è differenze significative da lotto a lotto delle attività enzimatiche e rischia di compromettere la riproducibilità dei risultati e richiede determinazione della concentrazione di lavoro per ogni lotto 26.
Nel cervello adulto, la rimozione della mielina da centrifugazione in gradiente di densità è un passo indispensabile per le applicazioni a valle, come la citometria a flusso o ulteriori studi sul gene o espressione della proteina. Uno dei principali vantaggi del protocollo è la procedura di densità monostrato che non richiede preparazione tempo di gradienti. Inoltre, il protocollo di differenziazione produce risultati affidabilis anche se effettuata da sperimentatori piuttosto inesperti. È priva di gradienti strati con densità vicini l'uno all'altro che sono difficili da pipetta senza disturbare l'interfaccia tra.
Sulla base della espressione del marcatore CD45 di superficie, il protocollo produce tre categorie principali di cellule del cervello ischemico. La stragrande maggioranza delle cellule parte di popolazione negativa CD45 che si compone di cellule neuronali, astrociti, ependimali e cellule endoteliali. La loro presenza abbondante è attribuita al gradiente di densità monostrato che mira soprattutto ad mielina efficiente e rimozione dei residui. Inoltre, una popolazione CD45 int che rappresenta microglia residente 27 può essere differenziata da un'alta popolazione CD45 che contiene principalmente infiltrazione leucociti ematogene. Tuttavia, va notato che la microglia attivata può adottare il fenotipo e la funzione delle cellule mieloidi del sangue-nato. Così, sophisticate solo applicandod tecniche come parabiosis 28, midollo osseo chimere 29 o l'analisi di mappatura destino 30 permettono una netta distinzione tra queste due popolazioni durante l'infiammazione.
L'analisi dei dati in citometria a flusso è spesso limitata alla distribuzione percentuale delle popolazioni di cellule specifiche. Tuttavia, quando si confrontano l'infarto dell'emisfero di tessuto cerebrale non infartuato questa informazione può essere fuorviante, perché non considera la conta leucocitaria totale del cervello che vengono cambiati dal danno ischemico. Così, per tracciare un quadro completo sulla grandezza e il fenotipo di infiltrati infiammatori dopo l'ictus relativa distribuzione di sottoinsiemi di cellule immunitarie dovrebbe essere integrato da numeri di cellulare assoluti. Quando si utilizza microsfere come descritto in questo protocollo, dispensazione di un volume del campione preciso è assolutamente obbligatorio per ottenere risultati attendibili. Inoltre, pipettaggio inverso è fortemente consigliato per evitare la formazione di schiuma nel tubo di conteggio. Arising bolle d'ariaridurrà il volume previsto di microsfere e quindi portare ad una sovrastima della assoluti CD45 conta alta dei leucociti nel campione.
In sintesi, questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per isolare le cellule immunitarie dal cervello. Può servire come un valido strumento per sezionare la complessità della risposta infiammatoria di ictus ischemico. Le applicazioni future includono le indagini sul ruolo dipendente dal tempo di sottoinsiemi monociti nella propagazione e la risoluzione dell'infiammazione cerebrale ischemico. Allo stesso modo, il ruolo del sistema immunitario adattativo dopo l'ictus è poco conosciuta. Analisi citofluorimetrica delle sottopopolazioni di cellule T identificati mediante l'espressione di fattori di trascrizione specifici sottoinsieme o citochine in situ potrebbe aiutare a chiarire il loro impatto sulla ripresa a lungo termine dopo l'ictus e promettenti quindi aperti per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Isabell Schulz per un eccellente supporto tecnico.
Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | use at room temperature |
Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
Silicone Tubing, 1m | World precision instruments | 503022 | |
Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Straight 1×2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
Cell strainer, 100µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
Omnican Fine dosage syringe 1ML | Braun | TBD | |
Cell strainer, 70µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
serological pipettes, 10ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
serological pipettes, 10ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
serological pipettes, 25ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
serological pipettes, 5ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
serological pipettes,25ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
serological pipettes,5ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
Tips, 0,1-10µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
Tips, 100-1000µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
Tips, 10-200µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
Reaction tubes 1,5ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
Reaction tubes 2ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
Bacteriological petri dish, 94x16mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
Falcon 15ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
Falcon 50ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |