Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.
Ischemische beroerte initieert een robuuste ontstekingsreactie die begint in het intravasculaire compartiment en het gaat om een snelle activering van de hersenen ingezeten cellen. Een belangrijk mechanisme van deze ontstekingsreactie is de migratie van circulerende immuuncellen naar de ischemische hersenen vergemakkelijkt door chemokine afgifte en verhoogde endotheliale expressie van adhesiemoleculen. -Brain binnenvallende leukocyten zijn bekend bij te dragen aan een vroeg stadium van het secundair ischemisch letsel, maar hun betekenis voor de beëindiging van ontsteking en later reparatie hersenen is pas onlangs is opgevallen.
Hier is een eenvoudig protocol voor de efficiënte isolatie van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen ontvangen. Na transcardial perfusie worden hersenhelften ontleed en mechanisch gescheiden. Enzymatische digestie met Liberase wordt gevolgd door dichtheidsgradiënt (zoals Percoll) centrifugatie myeline en celresten te verwijderen. Een groot voordeel van dit protocol is de enkellaags dichtheidsgradiënt procedure die niet vereist tijdrovende voorbereiding hellingen en betrouwbaar kan worden uitgevoerd. De aanpak levert zeer reproduceerbare celtellingen per hersenhelft en maakt meten verschillende flowcytometrie panelen in één biologische repliceren. Fenotypische karakterisering en kwantificering van de hersenen binnenvallende leukocyten na experimentele beroerte kan bijdragen tot een beter begrip van hun veelzijdige rol in ischemisch letsel en reparatie.
Herseninfarct veroorzaakt een aanhoudende ontstekingsreactie die begint snel na staken van de lokale bloedstroom en omvat vrijwel alle delen van het immuunsysteem. Een belangrijk kenmerk van deze ontstekingsreactie is een getimede influx van immuuncellen naar de hersenen die wordt aangedreven door de activering van hersenen endotheelcellen aanzienlijke chemokine uitscheiding en verhoogde sympathische uitstroom 1-3. Infiltratie van ontstekingscellen is eerder beschouwd schadelijk bij ischemische beroerte echter verschillende klinische studies ontworpen om willekeurig blok leukocyt uitgang naar de hersenen niet een meetbare klinisch voordeel 4 induceren. Meer recent werd duidelijk dat van monocyten afgeleide cellen in eerste instantie betrokken bij progressie van ischemische schade 5 ook een centrale rol zou kunnen spelen voor het oplossen van de ontsteking en de daaropvolgende weefselherstel 6.
Dankzij de identificatie van fenotypische en functional heterogeniteit onder monocyten en macrofagen, is de kennis over de rol van mononucleaire fagocyten in de ontwikkeling en resolutie van ontsteking aanzienlijk uitgebreid. In muizen kan circulerende monocyten worden ingedeeld in ten minste twee functioneel verschillende subsets volgens hun oppervlakte-expressie van lymfocyt antigen 6 complex (Ly-6C) 7. Terwijl Ly-6C hoge'inflammatory monocytes' duidelijk bleken essentieel voor de bestrijding van bacteriële infecties 8 om hun rol in steriele schade is controversieel. In ischemische beroerte, selectieve ablatie van CCR2 + Ly-6C hoge monocyten resulteerde in hemorragische infarct transformatie 6. Echter, dezelfde experimentele benadering verbeterd acute invaliditeit na hersenbloeding 9. Ook verschillende subsets van T-cellen worden verondersteld om ofwel schadelijk 10 of beschermende maatregelen uit te oefenen 11 in ischemisch hersenletsel, echter gegevens controversial 12,13 en warrants verder onderzoek. Gezien deze toenemende complexiteit, blijkt dat diepere kennis over de rol van de diverse immuuncellen in ischemisch letsel en reparatie cruciaal voor het vertalen experimentele bevindingen naar behandelingen die na een beroerte ontsteking.
Vandaag is de meest krachtige tool voor het analyseren van cellulaire immuunreacties is polychromatische flowcytometrie. Het maakt de identificatie en kwantificering van diverse immuuncelsubklassen op de plaats van ontsteking zonder de noodzaak om het systeem voorspanning in vivo labeling of genetische manipulatie 14. Gelijktijdige kleuring van celoppervlak markers met antilichamen tegen intracellulaire cytokinen 15 of transcriptiefactoren 16 bovendien informatie over de functionele status van afzonderlijke, fenotypisch geïdentificeerde cellen. Als een groot nadeel, zijn enkele celsuspensies vereist voor flowcytometrische assays en is informatie over localization van cellulaire infiltraten verloren. Hoewel histologie ideale ruimtelijke informatie te verkrijgen, wordt beperkt door het aantal antilichamen dat in een keer kan worden gebruikt om immuuncel subtypen te karakteriseren in een bepaald weefsel. Vandaag zal een combinatie van de aanwezigheid en afwezigheid van verschillende oppervlakte markers nodig ondubbelzinnig te identificeren zeldzame immuuncelsubklassen, vooral onderscheiden van monocyten afgeleide celpopulaties tijdens inflammatie 17.
We beschrijven een efficiënt protocol hoge aantallen leukocyten isoleren van de postischemische muizenhersenen met behulp van een single-layer dichtheidsgradiënt. De verkregen celsuspensies kan ofwel geanalyseerd met multidimensionale flowcytometrie of verder worden verrijkt door flow cytometrische sortering of immunomagnetische selectie zeer specifieke downstream analyses uitvoeren. De methode Gegevens transcardial perfusie, het verwijderen van de hersenhelften, dissociatie van hersenweefsel in één cel suspensions, dichtheidsgradiënt centrifugeren myeline verwijderen en antilichaamkleuring voor flowcytometrische analyse.
We beschrijven hier een eenvoudige en effectieve methode voor het isoleren van leukocyten uit het murine hersenen na experimentele beroerte. De aanpak betrouwbaar levert zeer reproduceerbare celtellingen per hersenhelft maakt om verschillende stroomsnelheden panelen meten één biologische repliceren.
Blijkbaar zal een onvolledige verwijdering van het bloed waaronder immuuncellen leiden tot een vertekend beeld van de werkelijke bedrag van inflammatoire cellen die de ischemische hersenen ingevoerd. Dus, als het gebruik van dit protocol bijzondere aandacht besteden aan grondige transcardial perfusie om besmetting van geïnfiltreerd immuuncellen met niet-inflammatoire circulerende leukocyten te voorkomen. Uit ervaring, het gebruik van botte naalden voor linkerventrikel punctie vermindert het risico op letsel van de interventriculare septum die perfusie van de systemische circulatie zou omzeilen. Opkomst van de perfusie vloeistof uit de neusgaten is een teken dat de perfusie pressureis te hoog, dus eenvoid stroomsnelheden> 10 ml / min. Pale om witte kleur van het hersenweefsel geeft een goede doorbloeding, terwijl roze kleur is een teken van een slechte doorbloeding.
Een andere belangrijke stap van dit protocol is efficiënt dissociatie van hersenweefsel mechanische fragmentatie en enzymatische afbraak omvat. Hakken het weefsel door de cel zeef kritisch verbeterde effectiviteit van proteasen verschaffen. Echter, wanneer het homogeniseren van het weefsel voorkomen dat te veel druk mononucleaire fagocyten zijn zeer gevoelig voor autolyse 22. Enzymatische digestie Liberase TL wordt aanbevolen dat een mengsel van sterk gezuiverd collagenase I en II dat lage concentraties van de neutrale protease thermolysine bevat. De directe vergelijking met de eerder beschreven isolatie protocollen 14,22,23 bleek significant hoger herstel van levensvatbare cellen door Liberase TL behandeling (KM ongepubliceerde gegevens). Vergeleken met collagenase die vaak gebruiktd voor de isolatie van de immuuncellen van de hersenen, Liberase TL bevat verwaarloosbare niveaus van endotoxine. Dit is van bijzonder belang indien cellen worden gesorteerd voor downstream analyse omdat hoge niveaus van endotoxine de activeringstoestand kan veranderen van immuuncellen 24 en ernstig afbreuk celkweek uitkomsten 25. Een ander nadeel van traditionele collagenase significant lot-to-lot verschillen in enzymactiviteiten die gevaar reproduceerbaarheid van de resultaten en vereist de bepaling van de werkconcentratie voor elke partij 26.
In de volwassen hersenen, myeline verwijdering door dichtheidsgradiënt centrifugatie is een noodzakelijke stap om verdere toepassingen zoals flowcytometrie of verdere studies op gen- of eiwitexpressie. Een groot voordeel van het protocol is de enkellaags density procedure die tijdrovende voorbereiding van hellingen vereist. Bovendien, de scheidingsprotocol produceert betrouwbaar resultaats, zelfs wanneer deze wordt uitgevoerd door nogal onervaren onderzoekers. Het mist gelaagd gradiënten met dichtheden dicht bij elkaar moeilijk zijn pipet zonder de interface tussen.
Op basis van de expressie van het oppervlak marker CD45, levert het protocol drie grote categorieën cel in de ischemische hersenen. De overgrote meerderheid van de cellen tot een CD45 negatieve populatie die bestaat uit neuronale cellen, astroglia, ependymale en endotheelcellen. De overvloedige aanwezigheid toegeschreven aan de enkellaags dichtheidsgradiënt die primair is gericht op efficiënte myeline en afvalverwijderingssysteem. Bovendien kan een CD45 int bevolking vertegenwoordigen inwoner microglia 27 worden onderscheiden van een CD45 hoge populatie die voornamelijk bestaat uit het infiltreren hematogene leukocyten. Er moet echter worden opgemerkt dat geactiveerde microglia het fenotype van de bloed-geboren myeloïde cellen kan vaststellen. Dus alleen het toepassen van sophisticated technieken zoals parabiosis 28, beenmerg chimeren 29 of het lot mapping analyse 30 maken een duidelijk onderscheid tussen deze twee populaties tijdens ontsteking.
Gegevensanalyse in flowcytometrie is vaak beperkt tot de procentuele verdeling van specifieke celpopulaties. Echter, bij het vergelijken van het infarct halfrond niet-geïnfarceerde hersenweefsel deze informatie kan misleidend zijn, omdat zij niet van mening totale hersenen leukocyten die zijn veranderd door ischemisch letsel. Dus, om een volledig beeld van de omvang en de fenotype van ontstekingsinfiltraten te trekken na een beroerte relatieve verdeling van het immuunsysteem cel subsets moet worden aangevuld met absolute cel aantallen. Bij gebruik van microbolletjes zoals beschreven in dit protocol, pipetteren van een nauwkeurig monstervolume absoluut noodzakelijk om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Bovendien wordt reverse pipetteren sterk aanbevolen om schuimvorming bij het tellen buis te voorkomen. Voortvloeiende luchtbellenzal het verwachte volume van de microbolletjes te verminderen en dus leiden tot een overschatting van de absolute CD45 hoog aantal leukocyten in het monster.
Kortom, dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare benadering van immuuncellen isoleren van de hersenen. Het kan dienen als een waardevol instrument om de complexiteit van de ontstekingsreactie op ischemische beroerte ontleden. Toekomstige toepassingen zijn onder meer onderzoek naar het tijdsafhankelijke rol van monocyten subsets in de voortplanting en de resolutie van ischemische ontsteking van de hersenen. Evenzo wordt de rol van het adaptieve immuunsysteem na een beroerte slecht begrepen. Flow cytometrische analyse van T-cel subpopulaties geïdentificeerd door de expressie van subgroep-specifieke transcriptiefactoren of cytokines in situ zou kunnen helpen om hun impact op de lange termijn het herstel na een beroerte en dus geopend veelbelovende mogelijkheden voor de ontwikkeling van nieuwe behandelmethoden te verduidelijken.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken Isabell Schulz voor een uitstekende technische ondersteuning.
Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | use at room temperature |
Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
Silicone Tubing, 1m | World precision instruments | 503022 | |
Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Straight 1×2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
Cell strainer, 100µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
Omnican Fine dosage syringe 1ML | Braun | TBD | |
Cell strainer, 70µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
serological pipettes, 10ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
serological pipettes, 10ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
serological pipettes, 25ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
serological pipettes, 5ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
serological pipettes,25ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
serological pipettes,5ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
Tips, 0,1-10µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
Tips, 100-1000µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
Tips, 10-200µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
Reaction tubes 1,5ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
Reaction tubes 2ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
Bacteriological petri dish, 94x16mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
Falcon 15ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
Falcon 50ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |