Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.
שבץ איסכמי יוזם תגובה דלקתית חזקה שמתחילה בתא intravascular וכרוכה הפעלה מהירה של תאי תושב המוח. מנגנון מפתח של התגובה הדלקתית הזו, ההגירה של תאי החיסון למוח איסכמי בהנחייתם שחרור chemokine וביטוי מולקולות הדבקה מוגברת האנדותל. לויקוציטים פולשים-מוח ידועים תורם פגיעת איסכמית משנית בשלב מוקדם, אבל משמעותם עבור סיום הדלקת ותיקון המוח מאוחר יותר כבר שמה לב רק לאחרונה.
כאן, פרוטוקול פשוט עבור בידוד יעיל של תאים חיסוניים מהמוח העכבר איסכמי מסופק. לאחר זלוף transcardial, ההמיספרות של המוח הם גזור ו ניתק מכנית. עיכול אנזימטי עם Liberase ואחריו שיפוע צפיפות (כגון Percoll) צנטריפוגה להסיר המיאלין פסול תא. אחד היתרונות הגדולים של i בפרוטוקול זהזה הליך שיפוע צפיפות שכבה האחת אשר אינו דורש הכנה גוזלת זמן של מילויים וניתן לבצעו באופן מהימן. גישת מניב ספירת תאים לשחזור מאוד לכל בחצי כדור מוח ומאפשרת למדידת מספר לוחות הזרימה cytometry לשכפל אחד ביולוגי. אפיון וכימות פנוטיפי של לויקוציטים פולשים למוח לאחר שבץ ניסיוני עשוי לתרום להבנה טובה יותר של התפקידים הרבים שלהם לפגיעת איסכמית ותיקון.
שבץ מוחי מעורר תגובה דלקתית מתמשכת שמתחילה במהירות לאחר הפסקת זרימת הדם המקומית וכרוכים כמעט כל חלקי המערכת החיסוניים. סימן ההיכר חשוב של תגובה דלקתית זה זרם מתוזמן של תאי מערכת חיסון אל המוח אשר מונעת על ידי ההפעלה של תאי אנדותל המוח, הפרשת chemokine משמעותית וגדילת יצוא אוהד 1-3. חדירת תא דלקתי נחשבה מזיקה בעבר השבץ איסכמי, עם זאת, ניסויים לטיפול למספר תוכנן ללא אבחנה לחסום יציאה לויקוציטים למוח הצליח לגרום תועלת קלינית מדידה 4. לאחרונה, התברר כי תאים מעורבים בתחילה נגזרות מונוציטים ב התקדמות ניזק איסכמי 5 עשויים גם לשחק תפקיד מרכזי עבור רזולוציה של רקמת דלקת ובעקבות תיקון 6.
הודות לזיהוי פנוטיפי functiההטרוגניות onal בין מונוציטים מקרופאגים, הידע על עצמו את התפקיד של פגוציטים mononuclear בפיתוח ברזולוציה של דלקת הרחיבה באופן משמעותי. בעכברים, מונוציטים במחזור ניתן לסווג לפחות שתי תת ברורים מבחינה תפקודית על פי ביטוי השטח שלהם מורכב 6 אנטיגן לימפוציטים (Ly-6C) 7. בעוד Ly-6C גבוהה monocytes''inflammatory הוצגה בבירור להיות חיוני על בקרת זיהומים חיידקיים 8, תפקידם פציעה סטרילית שנוי במחלוקת יותר. ב שבץ איסכמי, אבלציה סלקטיבית של מונוציטים CCR2 + Ly-6C גבוהים הביאה שינוי האוטם המורגי 6. עם זאת, באותה גישת הניסוי שפרה נכות חריפות לאחר תוך-מוחי דימום 9. באופן דומה, תת שונים של תאי T הם האמינו להפעיל או מזיק 10 או פעולות מגן 11 פגיעה מוחית איסכמי, עם זאת, הנתונים controversiאל 12,13 וכתבי אופציה חקירות נוספות. לאור מורכבות גובר, מתברר כי ידע עמוק על התפקידים של תאים חיסוניים המגוונים פגיעה איסכמית ותיקון חיוני תרגום ממצאי ניסוי לטיפולי מיקוד דלקת שבץ פוסט.
היום, הכלי החזק ביותר לניתוח תגובה חיסונית תאית חזקה הוא cytometry זרימה צבעוני. היא מאפשרת זיהוי וכימות של תת תאים שונים החיסונית באתר של דלקת ללא צורך להטות את המערכת על ידי תיוג in vivo או מניפולציה גנטית 14. מכתים סימולטני של סמנים פני תא עם נוגדנים נגד ציטוקינים תאיים 15 או שעתוק גורמי 16 בנוסף מספק מידע על מצב התפקודי של פרט, חוליות מזוהות phenotypically. כפי חיסרון אחד מרכזי, השעיות תא בודד נדרשים עבור מבחני תזרים cytometric ובכך מידע על localization של מחלחל הסלולר הולך לאיבוד. עם זאת, בעוד היסטולוגיה הוא אידיאלי כדי לקבל מידע מרחבי, היא מוגבלת במספר נוגדנים שיכולים לשמש בכל פעם מחדש לאפיין תת תא החיסון ברקמות בפרט. היום, שילוב של נוכחות וההיעדרות של סמני משטח שונים יש צורך חד משמעי לזהות תת תא חיסון נדיר, במיוחד אוכלוסיות תאים המובחנות נגזרות מונוציטים במהלך דלקת 17.
כאן אנו מתארים פרוטוקול יעיל לבודד מספר רב של לויקוציטים מהמוח העכבר postischemic באמצעות שיפוע צפיפות שכבה אחת פשוטה. מתלי התא המתקבלים ניתן לנתח באמצעות זרימה רבה ממדי cytometry או יותר להיות מועשר על ידי מיון תזרים cytometric או מבחר immunomagnetic לבצע ניתוחים במורד מאוד ספציפי. השיטה מפרט זלוף transcardial, הסרת ההמיספרות של המוח, דיסוציאציה של רקמת המוח לתוך תליוני תא בודדensions, צנטריפוגה שיפוע צפיפות להסרת המיאלין כמו גם מכתים נוגדן עבור ניתוח תזרים cytometric.
כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה עבור בידוד של לויקוציטים מהמוח בעכברים לאחר שבץ ניסיוני. הגישה באופן מהימן מניב ספירת תאים לשחזור מאוד לכל אונה במוח המאפשרת למדוד לוחות זרימה שונים לשכפל אחד ביולוגי.
ככל הנראה, הסרה חלקית של תאי מערכת החיסון בדם כולל תגרום השקפה מעוותת על הסכום בפועל של תאים דלקתיים שנכנסו המוח איסכמי. לפיכך, בעת השימוש בפרוטוקול זה לשים לב במיוחד זלוף transcardial היסודי על מנת למנוע זיהום של תאים חיסוניים הסתננו עם לויקוציטים במחזור הלא דלקתיים. מניסיון, את השימוש של מחטים בוטה ניקוב החדר השמאלי מפחיתה את הסיכון לפציעה של מחיצת האף interventricular אשר יעקפו זלוף של מחזור מערכתי. הופעתה של נוזל זלוף מהנחיריים סימן הוא כי זלוף pressureis גבוה מדי, וכך,ספיקות ריקות> 10 מיליליטר / דקה. בהיר עד צבע לבן של רקמת המוח מציין זלוף טוב בעוד צבע ורדרד הוא סימן זלוף עני.
עוד שלב קריטי של פרוטוקול זה הוא ניתוק יעיל של רקמת מוח שכולל פיצול מכאני, כמו גם עיכול אנזימטי. וקוצצים את רקמת דרך מסננת התא הוא קריטי כדי לספק יעילות משופרת של פרוטאזות. עם זאת, כאשר שמאחדים את הרקמות, למנוע לחץ מופרז כמו פגוציטים mononuclear רגישים מאוד autolysis 22. עבור TL Liberase עיכול אנזימטי מומלץ שהוא תערובת של לי collagenase נקיים במיוחד ו- II המכיל ריכוזים נמוכים של thermolysin פרוטאז ניטרלי. ההשוואה הישירה עם פרוטוקולי בידוד שתוארו לעיל 14,22,23 גילו התאוששות משמעותית גבוהה יותר של תאי קיימא על ידי טיפול Liberase TL (נתונים שלא פורסם ק''מ). לעומת collagenase שהוא מרבה להשתמשד עבור בידוד של תאים חיסוניים מהמוח, Liberase TL מכיל רמות זניחות של רעלן פנימי. זו היא בעלת חשיבות מיוחדת אם תאים מסודרים לניתוח במורד הזרם בגלל רמות גבוהות של רעלן פנימי עשוי לשנות את מצב ההפעלה של תאי מערכת החיסון 24 ולפגוע תרבית תאים קשות ותוצאות 25. חיסרון נוסף של collagenase המסורתית הוא הבדלים הרבה-אל-הרבה באופן מהותי את פעילות האנזים אשר מסכן שחזור של התוצאות מחייב קביעת ריכוז העבודה לכל מנה 26.
במוח בוגר, הסרת המיאלין על ידי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות היא צעד הכרחי עבור יישומים במורד כגון cytometry זרימה או מחקרים נוספים על גן או ביטוי חלבון. אחד היתרונות הגדולים של הפרוטוקול הוא ההליך צפיפות שכבה אחת אשר אינה דורשת הכנה גוזלת זמן של הדרגתיים. יתר על כן, פרוטוקול ההפרדה מייצר תוצאה אמינהזה אפילו כאשר היא מבוצעת על ידי הנסיינים די מנוסים. זה נטול הדרגתי שכבתי עם צפיפויות קרובות אחד לשני שקשה פיפטה מבלי להפריע את הממשק בין.
בהתבסס על הביטוי של CD45 סמן המשטח, הפרוטוקול מניב לשלושה קטגוריות תאים עיקריות במוח איסכמי. הרוב המכריע של תאים שייכים לאוכלוסייה שלילית CD45 מורכב תאים עצביים, astroglia, ependymal ותאי האנדותל. הנוכחות בשפע שלהם מיוחסת שיפוע צפיפות שכבה האחת שמטרתה בעיקר הסרת המיאלין ופסולת יעילות. בנוסף, אוכלוסיית int CD45 מייצג microglia תושב 27 ניתן להבדיל בין אוכלוסייה גבוהה CD45 המכילה שחדר לויקוציטים hematogenous בעיקר. עם זאת, יש לציין כי microglia מופעל רשאי לאמץ את הפנוטיפ ותפקוד של תאי מיאלואידית יליד דם. לפיכך, המתוחכם החלים רקד טכניקות כגון parabiosis 28, מח עצם מפלצות 29 או מיפוי גורל ניתוח 30 לאפשר הבחנה ברורה בין שתי אוכלוסיות אלה במהלך דלקת.
ניתוח נתונים ב cytometry זרימת מוגבל לעתים קרובות החלוקה היחסית של אוכלוסיות תאים ספציפיים. עם זאת, כאשר משווים את אוטם אונה אל רקמת המוח הלא אוטם מידע זה יכול להיות מטעה, משום שהוא אינו רואה ספירה לויקוציטים מוחית מוחלט המוחלפות על ידי פגיעה איסכמית. לכן, כדי לצייר תמונה מלאה על העצמה ואת הפנוטיפ של המחלחל דלקתי לאחר הפצה יחסי שבץ של תת תא חיסון צריכה להיות כהשלמת מספרים מוחלטים לתא. בעת השימוש microbeads כמתואר בפרוטוקול זה, pipetting של נפח הדגימה מדויק הוא ממש חיוני כדי לקבל תוצאות אמינות. יתר על כן, pipetting הפוכה מומלץ מאוד כדי למנוע היווצרות קצף בצינור והיד עוד נטויה. הנובע בועות אוויריקטין את היקף microbeads הצפוי ומכאן להוביל יתר של ספירה לויקוציטים גבוה מוחלטת CD45 במדגם.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק גישה קלה ואמינה כדי לבודד תאים חיסוניים מהמוח. זה יכול לשמש ככלי רב ערך כדי לנתח את המורכבות של התגובה הדלקתית כדי לשבץ איסכמי. יישומים עתידיים כולל חקירות על עצם את התפקיד תלוי זמן של תת מונוציטים ב התפשטות ורזולוציה של דלקת מוח איסכמי. באופן דומה, את התפקיד של מערכת חיסונית אדפטיבית לאחר השבץ הוא הבין היטב. ניתוח תזרים cytometric של תת-אוכלוסיות של תאי T שזוהו על ידי הביטוי של גורמי שעתוק ספציפי משנה או ציטוקינים באתרו עשוי לעזור להבהיר את השפיע על התאוששות לטווח ארוך לאחר שבץ ובכך שדרות הבטיח פתוחות לפיתוח גישות טיפוליות חדשות.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים Isabell שולץ לקבלת תמיכה טכנית מעולה.
Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | use at room temperature |
Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
Silicone Tubing, 1m | World precision instruments | 503022 | |
Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Straight 1×2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
Cell strainer, 100µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
Omnican Fine dosage syringe 1ML | Braun | TBD | |
Cell strainer, 70µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
serological pipettes, 10ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
serological pipettes, 10ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
serological pipettes, 25ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
serological pipettes, 5ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
serological pipettes,25ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
serological pipettes,5ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
Tips, 0,1-10µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
Tips, 100-1000µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
Tips, 10-200µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
Reaction tubes 1,5ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
Reaction tubes 2ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
Bacteriological petri dish, 94x16mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
Falcon 15ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
Falcon 50ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |