We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
RNA aracılı knockdowns yaygın gen ifadesini kontrol etmek için kullanılır. teknikler Bu çok yönlü ailesi bir dizi ile sentezlenir ve susturma için hedeflenen bir geni tamamlayıcı tasarlanabilir kısa RNA (Srna) kullanır. Srna doğrudan bir çok hücre tipinde kişiye veya çeşitli vektörler kullanılarak olabilir inşa için, gen ekspresyonu zahmetli genetik modifikasyon olmadan canlı hücreler bastırılmış edilebilir. En yaygın RNA demonte teknolojisi, RNA interferans (RNAi), hedef mRNA'nın endojen RNA kaynaklı kompleks (RISC) susturma aracılık sekans tanıma ve bölme merkezi kullanır. Bu teknik uygulamaları nedenle RISC sentezleyen organizmaların öncelikle ökaryotlar ile sınırlıdır. Son zamanlarda, RNA Biyo yeni nesil RNA vasıtasıyla gen ekspresyonunu kontrol etmek için alternatif bir mekanizmalar geliştirmişlerdir ve böylece bakteriler olası RNA aracılı gen knockdowns yapılmıştır. Burada gen Expres susturma için bir yöntem tarifE. sion coli işlevsel RNAi andırıyor. Bu sistemde, bir suni fajmid dizisini hedeflemek için tasarlanmış olabilir srna ifade etmek için tasarlanmıştır. Sentezleme konstruktu E. nüfusu teslim stabil bir plazmid gibi replike edebilmekte ve bundan sonra litik olmayan M13 fajı ile coli hücreleri. Antisens tanınması ve hedef mRNA'nın susturulması E. endojen Hfq proteini aracılık etmektedir E. coli. Bu protokol, antisens Srna tasarımı fagemit vektör inşa, M13 bakteriyofaj içine fagemit ambalaj, enfeksiyon için bir canlı hücre popülasyonu hazırlanması ve enfeksiyon kendisi yapmak için yöntemler içerir. floresan protein mKate2 ve antibiyotik direnç geni kloramfenikol asetiltransferaz (CAT) temsilcisi verileri oluşturmak için ve demonte etkinliğini ölçmek için hedeflenir.
RNA aracılı gen knockdowns iki aşamada devam edin. İlk olarak, bir RNA molekülü, bir hücre hattı veya çalışma organizmaya verilir. İkinci olarak, endojen RNA bağlayıcı proteinler, RNA hedef tanınmasını kolaylaştırmak ve susturma etkisi üretmek. Tüm RNA demonte teknolojileri kolayca ilgi belirli bir hedef maç için üretilebilir sentetik sRNAs özelleştirilebilir doğası, yarar. Ancak, RNA alımı ve sessizliğini moleküler ayrıntıları nerede ve nasıl RNA knockdowns uygulanabilir kısıtlayıcı, model sistem çok değişkendir.
Nematod, iki-şeritli RNA (dsRNA) molekülleri ortamda veya dsRNA eksprese eden E. nüfuslu solucanlar beslenmesi ile doğrudan sokulabilir coli hücreleri 1,2. Drosophila olarak, RNAi, sadece kültür ortamı 4 dsRNA eklenerek dsRNA 3 embriyolar microinjecting elde ya da hücre hatları uygulanabilir. Memeli hücre hatlarında,Sentetik küçük müdahale RNA'lar (siRNA'lar), lipozomlar 3,6 paketlenmiş, elektroporasyon 1,2,5 canlı hücre teslim veya DNA plazmid vektörleri 4,7 eksprese edilebilir. RNA türlerinin sitozolde ulaştığında, RNAi yolu, dsRNA işlemek hedefin antisens tanınmasını kolaylaştırmak ve konak bağlı, translasyonel baskıyı, mRNA bozulmalarını veya heterokromatin oluşumunu katalize etmek için RISC kompleksi dayanır.
Bu gereksinimler nedeniyle, klasik RNAi sadece verimli eksojen RNA sürebilir ve RISC veya RISC benzeri aktivite ifade organizmalar yapılabilir. Özellikle, bu model bakterisi E. dışlar RNAi yolu yoksun coli. Ancak, sentetik biyoloji son gelişmeler teslimat sorunu ve susturma sorunu hem çözmek için araçlar sağlar.
Bu protokolde, Srna yapılar E. ifade edilir DNA vektöründen coli li teslimM13 fajemid / yardımcı sistemini kullanarak hücrelerin Ving. Bir fagemit replikasyon bir faj türevli F1 kökenli herhangi bir plazmiddir. Bir yardımcı plazmid, bu durumda M13KO, viral parçacıkları üretmek için gerekli tüm makine taşır, ama replikasyon ve paketleme için yeterli değildir kendisidir. Bir fajemid ve yardımcı plazmid-dönüştürülmüş co zaman, tek başına fagemit, f1 kökenli çoğaltılmış paketlenmiş ve salgılanır. Vectorized fagemit canlı E. enfekte sonra yetkili F pilus yoluyla E. coli.
Bu sistemde, susturulması etkisi hedef bağlayıcı sekansı ile bir iskele sekansı birleştiren özel Srna kasetleri üretilmektedir. Hedef bağlayıcı dizi tipik ribozom bağlanma yeri (RBS) olarak, bir mRNA hedef antisens 24 baz çifttir. Na ve arkadaşları 8 tarafından geliştirilen iskele dizisi, MICC, E. endojen küçük bir düzenleyici RNA çıkarılan bir Hfq bağlayıcı motifini E. coli. Hfq proteini RNA-RNA-bağlanma uyarırg ve mRNA degradasyon, RNAi RISC benzer, bu sistemde bir amaca hizmet. Şekil 1 Srna kaseti yapısı, fagemit vektörleştirme ve susturma mekanizması dahil olmak üzere faj aracılı Srna knockdowns için tam bir şemayı göstermektedir.
Bir yöntemde E. gen ifadesini modüle etmek için E. coli, Srna susturma, basit, hızlı ve çok yönlüdür. Hedeflenen E. E. coli fajemid yayma ve Srna ifade ötesinde yatar değildir. Bu büyük heterolog yapıları ifadesi hücresel kaynakları 9 zorlayabilir sentetik biyoloji veya temel araştırma kapsamında ilgili olabilir. Yeni hedeflerle fajmidler tek PCR ile üretilen ve fagemid dönüşüm bir gün sonra hasat edilebilir. Son olarak, hemen hemen her mRNA hedeflenebilir. Srna düzenlemesi kaseti (standart plazmit üzerinde)>% 90, tipik 8 baskı düzeyleri ile metabolizma hedeflerin çeşitli çalışma gösterilmiştir.
<p class = "jove_content"> Bu protokol üretir ve fajemid doğumlu Srna 10 kasetlerinin kullanarak daha önceki çalışmaları genişletir. İlk olarak, bir paket fagemit E. bir parti kültür ilave edilir E. coli hücreleri ve floresan protein mKate2 ekspresyonunu kapatmak için kullanılabilir. Sonradan floresan değişiklikleri gerçek zamanlı olarak takip edilmektedir. İkinci olarak, CAT genini aşağı vurma agar plakaları üzerinde fenotipik kloramfenikol direncini azaltmak için gösterilmiştir. Her iki durumda da, fagemit kendisi enfeksiyon oranı, bağımsız bir yok etme verimliliğinin ölçülmesine izin verecek şekilde, bir GFP işaretleyici taşımaktadır.Mevcut metot hedefsiz kontrollerle karşılaştırıldığında mKate floresan seviyelerinde% 80 azalma sağlanmıştır. Bu komple susturma gözlenmemiştir ve% 50-90 verim 16,17 tipik başka RNA demonte yöntemleri ile uyumludur. fenotipik düzeyde, CAT-hedefli knockdowns anlamlı kloramfenikol direnci zayıflatır ve bazı şartlar altında onu ortadan kaldırmak için başardık.
Demonte fenotip sadece birkaç saat sonrası enfeksiyon (Şekil 3B) sonra nüfus düzeyinde saptanabilir oldu. Bu faj tabanlı bir teslim önemli bir özellik gösterilmiştir: yüksek yok etme frekansı önceden genetik modifikasyon kesikli kültürde doğrudan elde edilebilir. Plazmid dönüşüme veya genomik entegrasyon kullanılarak geleneksel genetik modifikasyon farklı faj enfeksiyonu nüfus tek bir izole koloniden yeniden yetiştirilebilir gerektirmez. Bu faj enfeksiyonun etkileri Explor olmasını sağlar18 ya da genetik olarak karışık doğal nüfus 19 biyofilm gibi önceden var olan mekansal yapıları ile karmaşık mekansal dinamikleri 11 ile popülasyonlarında ed.
Bu yöntemde kritik bir safha, yüksek titrede paketlenmiş fajmid üretimidir. faj parçacığı üretimi ile ilişkili metabolik yükü fajemid üretim familyasından mutasyon ya da plazmid kaybı yüksek oranda neden olabilir. Fagemit üretim suşu tek bir birlikte dönüşmüş koloniden doğrudan kültüre ve buzdolabında değil, dondurulmuş veya faj hasat öncesinde alt kültüre edilmesi tavsiye edilir. E. fagemit ve yardımcı plazmit sokulması sırasında eş-dönüşüm düşük verimliliği de gözlenebilir Aynı anda E. coli. Bu durumda, daha yüksek verim, daha sonra ilk olarak bir yardımcı plazmid transforme fajmid ile müteakip transformasyonu için yardımcı plasmidi taşıyan yetkin hücrelerin hazırlanması ile elde edilebilir.
Phagemid enfeksiyon veya Srna sentezleme aynı zamanda, hedef hücreler üzerinde saptanabilir bir metabolik yük getirir ve bazı fenotipik pertürbasyon neden olabilir. Hücreler fagemit hedefleme CAT (Şekil 3) ile enfekte edilmiştir, örneğin, mKate2 floresan bir azalma da gözlenmiştir. M13 ile Enfeksiyon E. sistemik stres tepkileri tetiklemek için düşünce değil coli 20, ama dolaylı olarak transkripsiyonel desenleri değiştirebilir. Alternatif olarak, fajmid dahil GFP veya ampisilin direnç işaretçileri mKate2 ifade ve büyümeyi 9 azaltarak, hücresel kaynaklar için rekabet edebilir. Son olarak, Srna kaset kendisi küresel Hfq proteinini titre edilerek gen ekspresyon profillerini değiştirmek, ya da off-hedef mRNA susturma yoluyla olabilir. Kapalı hedef etkileri in vivo RNAi 21-23 hedefleyen yaygındır, ancak sistematik bu sistem için araştırılmalıdır henüz.
Bu yöntemin bir sınırlama olduğu enfeksiyonun ka olduğuVerimliliği olmayan bazı enfekte olmuş bakteri popülasyonunda korunmasına izin az% 100'dür. Bu çalışma ve daha önceki çalışmaları 10 sonuçları enfekte olmayan hücreler nihai nüfusun% 1-10 olarak öne sürmek, ve gözlenen nonsilenced fenotipleri çoğu sorumludur. M13-direnci verilmesi için muhtelif yollar pilus ifadesi 24 en yaygın olan mutasyon kaybı ile, bilinmektedir. Bu sınırlamaların ışığında, kontroller yüksek enfeksiyon oranları ve demonte verimliliğini doğrulamak için kullanılmalıdır.
Bazı uygulamalar için bir başka potansiyel sınırlama yardımcı faj kontamine arada transferidir. M13K07 mutasyona uğramış bir paketleme sinyali içermesine rağmen, faj üretimi ve ilk enfeksiyon olayı 25 dışına faj yayılmaya devam etmesi için yetkin hücrelerin sonuçlanan düşük bir frekansta faj kapsid içine paketlenmiş ve enfekte popülasyonları aktarılabilir. yardımcı faj yapılan değişiklikler etkili olduğu kanıtlanmıştırAzaltılmış faj üretimi 26 pahasına olsa bazen, spesifik olmayan ambalaj azaltmayı.
Engineered bakteriyofaj E. için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir büyüyen bir nüfusa yeni genlerin hızlı teslimat sağlayan coli sentetik biyoloji,. Yeni çalışmalar hücrelerarası iletişim devrelerini 11 üretilen ya da antibiyotik direncini bastırmak için transkripsiyon faktörlerini ifade 27 yolaklarıyla etti. Burada sunulan protokol programlanmış RNA'lar yoluyla bakteriyel fizyolojisinin kontrolünü sağlayan araçları büyüyen bir koleksiyon ekler. Nükleaz aktivitesi ortadan kaldırmak için mutasyona uğradığı zaman CRISPR-Cas nükleazlar, RNA yönlendirmeli geni hedef 17,28 transkripsiyon bastırmak için gösterilmiştir. Bunun aksine, Srna susturulması translasyon düzeyinde çalışır ve dışsal protein ekspresyonunu gerektirmemektedir. Yeni nesil Biyoteknoloji kompleksi fenoksi program faj aracılı teslim transkripsiyonel ve çeviri kontrol birleşebilirlerGerçek zamanlı türleri.
The authors have nothing to disclose.
Bu iş için fon Paris Bettencourt iGEM takımı destek Fondation Bettencourt Schueller tarafından sağlandı. Biz teknik yardım ve tavsiye için İNSERM U1001 araştırma ünitesi ve Chantal Lotton teşekkür ederiz. Fajmid Litmus28i_J23115-B0032-GFP Monica Ortiz ve Stanford Drew Endy tarafından sağlandı.
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |