We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
وتستخدم على نطاق واسع knockdowns بوساطة الحمض النووي الريبي للسيطرة على التعبير الجيني. هذه العائلة تنوعا من تقنيات يجعل من استخدام الحمض النووي الريبي قصيرة (الحمض الريبي النووي الذواب) التي يمكن توليفها مع أي تسلسل والمصممة لتكمل أي الجينات المستهدفة لإسكات. لأنه لا يمكن إدخالها إلى العديد من أنواع الخلايا مباشرة أو باستخدام مجموعة متنوعة من ناقلات الحمض الريبي النووي الذواب يبني، التعبير الجيني يمكن قمعها في الخلايا الحية دون التعديل الوراثي شاقة. الحمض النووي الريبي الأكثر شيوعا التكنولوجيا ضربة قاضية، تدخل الحمض النووي الريبي (رني)، يستفيد من إسكات المعقدة (RISC) الناجم عن الحمض النووي الريبي للتوسط الذاتية تسلسل الاعتراف والانقسام من مرنا الهدف. لذا تقتصر تطبيقات هذه التقنية إلى RISC، معربا عن الكائنات الحية، في المقام الأول حقيقيات النوى. في الآونة الأخيرة، جيل جديد من التكنولوجيا الحيوية RNA وضعت آليات بديلة للسيطرة على التعبير الجيني عن طريق الحمض النووي الريبي، وهكذا أصبح ممكنا knockdowns الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي في البكتيريا. نحن هنا تصف طريقة لإسكات الجينات اكسبريسسيون في E. القولونية يشبه وظيفيا رني. في هذا النظام تم تصميم phagemid الاصطناعية للتعبير عن الحمض الريبي النووي الذواب، والذي قد صمم لاستهداف أي تسلسل. يتم تسليم بناء التعبير لسكان E. خلايا القولونية مع فج M13 غير التحللي، وبعد ذلك أنها قادرة على تكرار مستقر كما البلازميد. وتوسطت الاعتراف العقاقير وإسكات مرنا الهدف من البروتين Hfq، الذاتية لE. القولونية. ويشمل هذا البروتوكول طرق لتصميم الحمض الريبي النووي الذواب العقاقير، وبناء ناقلات phagemid، التعبئة والتغليف وphagemid إلى M13 الجراثيم، وإعداد السكان الخلية الحية للعدوى، وأداء العدوى نفسها. وتستهدف بروتين فلوري mKate2 والكلورامفينيكول أسيتيل المقاومة للمضادات الحيوية الجين (CAT) لتوليد البيانات تمثيلا ولقياس فعالية ضربة قاضية.
knockdowns الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي المضي قدما في مرحلتين. أولا، يتم إدخال جزيء RNA إلى خط الخلية أو الكائن الحي من الدراسة. ثانيا، البروتينات ملزم RNA الذاتية تسهل الاعتراف الحمض النووي الريبي الهدف وتنتج تأثير إسكات. تستفيد جميع التكنولوجيات RNA ضربة قاضية من طبيعة قابلة للتخصيص من sRNAs الاصطناعية، والتي يمكن أن تنتج بسهولة لتتناسب مع هدف محدد من الفائدة. ومع ذلك، فإن التفاصيل الجزيئية امتصاص الحمض النووي الريبي وإسكات تختلف على نطاق واسع عبر نظام نموذجي، تقييد أين وكيف يمكن تطبيقها knockdowns الحمض النووي الريبي.
في الديدان الخيطية، RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) جزيئات يمكن إدخالها مباشرة في وسائل الإعلام أو عن طريق تغذية الديدان التي يبلغ عدد سكانها الرنا المزدوج الجديلة، معربا عن E. خلايا القولونية 1،2. في ذبابة الفاكهة، رني يمكن أن يتحقق عن طريق microinjecting الأجنة مع الرنا المزدوج الجديلة 3، أو ينفذ في خطوط الخلايا ببساطة عن طريق إضافة الرنا المزدوج الجديلة إلى مستنبت 4. في خطوط خلايا الثدييات،قد يتم تسليم الاصطناعية الرنا التدخل الصغيرة (الرناوات siRNAs) إلى الخلايا الحية التي Electroporation لل1،2،5، وتعبئتها في الجسيمات الشحمية 3،6، أو أعرب من ناقلات البلازميد 4،7. وبمجرد وصول الأنواع RNA العصارة الخلوية، يعتمد مسار رني على مجمع RISC لمعالجة الرنا المزدوج الجديلة، تسهيل التعرف العقاقير من الهدف، وتحفيز القمع متعدية، وتدهور مرنا، أو تشكيل المغاير، اعتمادا على المضيف.
وبسبب هذه المتطلبات، الكلاسيكية رني يمكن القيام بها إلا في الكائنات الحية التي تتناول RNA خارجي بكفاءة والتعبير عن RISC أو نشاط RISC مثل. والجدير بالذكر أن هذا يستبعد نموذج بكتيريا E. القولونية، التي تفتقر إلى مسار رني. ومع ذلك، التطورات الحديثة في علم الأحياء الاصطناعية توفر الأدوات اللازمة للحل على حد سواء مشكلة تسليم ومشكلة إسكات.
في هذا البروتوكول، ويتم التعبير عن ثوابت الحمض الريبي النووي الذواب في E. القولونية من ناقلات الحمض النووي تسليمها للىفينج الخلايا باستخدام نظام phagemid / المساعد M13. وphagemid هو أي البلازميد مع الأصل المشتقة فج F1 النسخ المتماثل. البلازميد المساعد، في هذه الحالة M13KO، يحمل كل المعدات اللازمة لإنتاج جزيئات فيروسية، ولكن ليس في حد ذاته المختصة للنسخ المتماثل والتعبئة والتغليف. عندما شارك في حولت phagemid والبلازميد المساعد، يتم نسخ phagemid وحدها في أصل F1، وتعبئتها ويفرز. وphagemid vectorized هو ثم المختصة لتصيب الحية E. القولونية عن طريق شعرة F.
في هذا النظام، وينتج تأثير إسكات بواسطة أشرطة الحمض الريبي النووي الذواب مخصصة الجمع بين تسلسل سقالة مع تسلسل ملزم الهدف. تسلسل ملزم الهدف هو 24 زوجا قاعدة العقاقير إلى الهدف مرنا، وعادة في موقع ملزمة الريبوسوم (RBS). تسلسل سقالة، التي وضعتها نا وزملاؤه 8، يحتوي على عزر ملزم Hfq المستخرجة من MICC، وهو RNA التنظيمي صغير الذاتية لE. القولونية. البروتين Hfq يحفز الحمض النووي الريبي RNA المربوطة ز وتدهور مرنا، يقضي دور في هذا النظام مشابه لRISC في رني الشكل 1 يصور المخطط الكامل لknockdowns الحمض الريبي النووي الذواب بوساطة فج، بما في ذلك بنية الحمض الريبي النووي الذواب كاسيت، كمية موجهة phagemid، وإسكات الآلية.
كوسيلة لتعديل الجينات في هاء القولونية، الحمض الريبي النووي الذواب إسكات بسيط وسريع وتنوعا. هاء المستهدفة لا مثقلة القولونية وراء الترويج لphagemid والتعبير عن الحمض الريبي النووي الذواب. وقد يكون ذلك مناسبا في سياق البيولوجيا التركيبية أو البحوث الأساسية حيث التعبير عن ثوابت مغاير أكبر يمكن أن يجهد موارد الخلوية 9. Phagemids مع أهداف جديدة يمكن أن تنتج مع PCR واحد وحصاد يوم واحد بعد التحول phagemid. وأخيرا، أي ما يقرب من مرنا يمكن أن تكون مستهدفة. وقد تبين اللائحة كاسيت الحمض الريبي النووي الذواب (على البلازميد قياسي) للعمل على مجموعة متنوعة من الأهداف في التمثيل الغذائي لديهم مستويات القمع النموذجية> 90٪ 8.
<p claSS = "jove_content"> هذا البروتوكول يستنسخ ويوسع على العمل في وقت سابق باستخدام phagemid المولد الحمض الريبي النووي الذواب أشرطة 10. أولا، يتم إدخال phagemid تعبئتها إلى ثقافة دفعة من E. خلايا القولونية وتستخدم لإسكات التعبير عن بروتين فلوري mKate2. ويتم رصد التغيرات مضان اللاحقة في الوقت الحقيقي. ثانيا، هدمت الجينات CAT يظهر للحد من مقاومة الكلورامفينيكول المظهرية على لوحات أجار. في كلتا الحالتين، فإن phagemid نفسه يحمل علامة GFP، مما يسمح معدل الإصابة إلى أن تقاس بشكل مستقل عن كفاءة ضربة قاضية.حقق الأسلوب الحالي 80٪ تخفيض في مستويات مضان mKate مقارنة مع الضوابط غير مستهدفة. وهذا يتماشى مع أساليب ضربة قاضية RNA الأخرى، حيث لا يلاحظ إسكات والكفاءة الكاملة 50-90٪ نموذجية 16،17. وعلى المستوى المظهري، تمكنت كبير في التخفيف من مقاومة الكلورامفينيكول، والقضاء عليه في ظل بعض الظروف knockdowns المستهدفة اتفاقية مناهضة التعذيب.
كان النمط الظاهري ضربة قاضية للكشف على مستوى السكان بعد بضع ساعات فقط بعد الإصابة (الشكل 3B). وهذا يوضح سمة هامة من سمات الولادة في فج: تردد ضربة قاضية عالية يمكن الحصول عليها مباشرة في ثقافة دفعة دون تعديل وراثي مسبق. على عكس التعديلات الوراثية التقليدية باستخدام التحول البلازميد أو التكامل الجيني، لا يتطلب عدوى الفيروس التي يبلغ عدد سكانها إعادة نمت-من مستعمرة معزولة واحدة. وهذا يسمح للآثار العدوى فج ليكون EXPLORإد في السكان مع ديناميات المكانية المعقدة 11، مع الهياكل المكانية موجودة مسبقا مثل الأغشية الحيوية 18، أو في السكان الطبيعية مختلطة وراثيا 19.
خطوة حاسمة في هذه الطريقة هو إنتاج phagemid تعبئتها في عيار عالية. عبء الأيض المرتبطة بإنتاج فج الجسيمات قد يؤدي إلى ارتفاع معدلات الطفرة أو فقدان البلازميد في سلالة إنتاج phagemid. فمن المستحسن أن سلالة إنتاج phagemid يمكن تربيتها مباشرة من مستعمرة cotransformed واحدة وليس المبردة والمجمدة أو دون مثقف، قبل الحصاد فج. ويمكن أيضا أن لوحظ انخفاض كفاءة شارك في التحول عند تقديم phagemid والمساعد البلازميد E. القولونية في وقت واحد. في هذه الحالة، يمكن الحصول على زيادة الكفاءة عن طريق تحويل البلازميد المساعد الأول، ثم إعداد الخلايا المختصة تحمل البلازميد المساعد للتحول لاحقا مع phagemid.
فاعدوى gemid أو التعبير الحمض الريبي النووي الذواب أيضا يفرض عبئا التمثيل الغذائي للكشف على الخلايا المستهدفة، ويمكن أن يؤدي في بعض الاضطراب المظهري. على سبيل المثال، لوحظ وجود انخفاض في mKate2 مضان حتى عندما كانت الخلايا المصابة مع phagemid تستهدف CAT (الشكل 3). ولا يعتقد العدوى مع M13 لتحريك استجابات التوتر النظامية في E. القولونية 20، ولكن قد يغير أنماط النسخي بشكل غير مباشر. بالتناوب، وGFP أو مقاومة الأمبيسلين علامات المدرجة على phagemid قد تنافس على الموارد الخلوية، والحد من التعبير mKate2 و 9 النمو. وأخيرا، فإن كاسيت الحمض الريبي النووي الذواب في حد ذاته قد يغير عالميا ملامح التعبير الجيني عن طريق المعايرة البروتين Hfq، أو من خلال بعيدا عن الهدف مرنا إسكات. آثار الهدف خارج شائعة في المجراة رني استهداف 21-23، لكنها حتى الآن لم يتم التحقيق بشكل منهجي لهذا النظام.
واحد الحد من هذا الأسلوب هو أن ايفي العدوىالمشمول أقل من 100٪، والسماح لبعض البكتيريا غير المصابة لتستمر في عدد السكان. وتشير نتائج هذا العمل وعمل في وقت سابق 10 أن الخلايا غير مصاب تمثل 1-10٪ من السكان النهائي، وهي المسؤولة عن معظم الظواهر nonsilenced ملاحظتها. ومن المعروف أن العديد من الطرق المؤدية إلى M13-المقاومة، مع كونها خسارة طفرية الأكثر شيوعا من شعرة التعبير 24. في ضوء هذه القيود، يجب استخدام الضوابط لتأكيد معدلات الإصابة العالية والكفاءة ضربة قاضية.
الحد محتمل آخر لبعض الطلبات هو نقل عرضية من تلويث المساعد فج. على الرغم من أن M13K07 يحتوي على إشارة التعبئة والتغليف متحولة، ويمكن تعبئتها في القفيصة فج في التردد المنخفض ونقلها إلى السكان المصابين، مما أدى إلى خلايا مختصة لإنتاج فج واستمرار انتشار فج ما وراء الحدث الإصابة الأولية 25. وقد أثبتت تعديلات على فج المساعد الفعالفي خفض التعبئة والتغليف غير محددة، على الرغم من أن في بعض الأحيان على حساب الإنتاج انخفاض فج 26.
أصبحت الجراثيم المهندسة أداة لا غنى عنها لE. علم الأحياء الاصطناعية القولونية، مما يتيح تسليم سريع للجينات جديدة لتزايد عدد السكان. وقد أنتجت العمل مؤخرا الدوائر الاتصالات بين الخلايا 11 أو عبر عوامل النسخ لقمع المقاومة للمضادات الحيوية الممرات 27. بروتوكول المعروضة هنا يضيف إلى مجموعة متزايدة من الأدوات التي تسمح السيطرة على علم وظائف الأعضاء البكتيرية من خلال الرنا المبرمجة. nucleases كريسبر-CAS، عندما تحور للقضاء على النشاط نوكلياز، وقد ثبت أن قمع النسخ على أهداف الجينات الموجهة RNA 17،28. في المقابل، الحمض الريبي النووي الذواب إسكات يعمل على مستوى متعدية ولا يحتاج بروتين تعبير خارجي. التكنولوجيا الحيوية الجيل القادم قد توحد السيطرة النسخي ومتعدية مع تسليم بوساطة فج لبرنامج pheno معقدةأنواع في الوقت الحقيقي.
The authors have nothing to disclose.
تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل مؤسسة بيتنكور Schueller في دعم فريق باريس بيتنكور iGEM. نشكر وحدة INSERM بحث U1001 وشانتال Lotton للحصول على المساعدة الفنية والمشورة. وقدمت Phagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP التي كتبها مونيكا أورتيز ودرو ENDY من جامعة ستانفورد.
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |