Summary

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Published: December 23, 2015
doi:

Summary

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

Abstract

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

Introduction

Miofibre individuali sono grandi, le cellule sinciziale altamente organizzati. Ci sono alcuni modelli di coltura cellulare per il muscolo; tuttavia, questi modelli hanno come principale limitazione che non fanno differenza completamente in fibre muscolari mature. Ad esempio, le linee cellulari C2C12 e L6 sono derivati ​​da topi e ratti, rispettivamente 1-4. In condizioni di deprivazione di siero, i mononucleari cellule "mioblasti-like" cessano proliferazione, subiscono il ritiro del ciclo cellulare, ed entrano nel programma miogenico che formano le cellule multinucleate con sarcomeri, indicati come miotubi. Con condizioni di coltura prolungata, miotubi possono esibire proprietà contrattili e "contrazione", nella cultura. Linee cellulari umane hanno ormai stati istituiti 5. In aggiunta a queste linee cellulari immortalizzate, mioblasti mononucleate possono essere isolate dal muscolo e sotto le condizioni simili di deprivazione di siero formeranno miotubi. Queste linee cellulari e colture di mioblasti primari sono altamente usoFul perché possono essere trasfettate con plasmidi o trasdotte con virus e usate per studiare processi biologici cellulari di base. Tuttavia, queste cellule, anche se indotto a formare miotubi, mancano molte delle caratteristiche salienti di organizzazione muscolo maturo. In particolare, miotubi sono molto più piccoli singole fibre muscolari mature e non hanno la forma normale di miofibre. Criticamente, miotubi mancano trasversali (T-) tubuli, la rete membranosa richiesta per il rilascio del Ca 2+ efficiente in tutto il mioplasma.

Un metodo alternativo per mioblasti primaria o linee cellulari miogeniche comporta usando fibre muscolari mature. Transgenesi può essere impiegato per stabilire espressione delle proteine ​​tag, ma questo metodo è costoso e richiede tempo. In vivo elettroporazione di muscoli del mouse è emerso come un metodo preferito per la sua velocità e affidabilità 6-10.

Metodi per elettroporazione in vivo e l'isolamento efficace di miofibre have stato ottimizzato per il mouse flessore brevis (FDB) muscolare 6. I metodi possono essere completate rapidamente e sono minimamente invasiva per indurre espressione vivo da plasmidi. Questo approccio è ora combinata con metodi di imaging ad alta risoluzione tra cui l'imaging dopo interruzione del laser del 6,7 sarcolemma. La combinazione di coloranti fluorescenti e espressione di proteine ​​marcate fluorescenza può essere utilizzata per monitorare cellulari processi biologici miofibre mature.

Protocol

I metodi in questo studio sono stati eseguiti in conformità con l'etica Feinberg School of Medicine della Northwestern University Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) le linee guida approvate. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. Procedura sperimentale 1. per elettroporazione in vivo del flessore Brevis (FDB) Muscle Bundle in mouse Plasmidi di progettazione per l'espressione in vivo utilizzando un promotore saputo espri…

Representative Results

Elettroporazione è una tecnica minimamente invasiva che introduce efficacemente purificato plasmide DNA nel flessore brevis (FDB) fascio muscolare (Figura 1A). Sette giorni dopo la transfezione fluorescently proteina tag viene visualizzato nella miofibre isolate (Figura 1B). Fibre isolate sono poi placcati e preparate per l'imaging su un microscopio confocale. Le fibre possono essere sottoposti a lesione indotta da laser. Colorante FM può essere ut…

Discussion

L'utilizzo di elettroporazione per studiare le proteine ​​fluorescenti tag in vivo è ideale per lo studio del muscolo in assenza di opportuni modelli di linee cellulari che riproducono fedelmente l'intera struttura cellulare del muscolo. Questo protocollo descrive l'utilizzo di elettroporazione e ad alta risoluzione microscopia confocale a fornire immagini dettagliate di localizzazione delle proteine ​​e la traslocazione dopo ferimento laser. Questo metodo può essere adattato per studiare …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede NS047726, NS072027, e AR052646.

Materials

DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50ml +100g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10mM HEPES
pH7.4 in H2O
1ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100mg / 50ml DMEM
Falcon 60mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock
1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

References

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Cite This Article
Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

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