This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
myofibers الفردية هي خلايا المخلوي كبيرة، عالية التنظيم. هناك عدد قليل من النماذج خلية ثقافة العضلات. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لديها كما قيدا رئيسيا على أنها لا تفرق تماما في myofibers ناضجة. على سبيل المثال، وتستمد خطوط الخلايا C2C12 وL6 من الفئران والجرذان على التوالي 1-4. في ظل ظروف المجاعة في الدم، وخلايا وحيدة النواة "شبيهة بالخلايا العضلية الجذعية" وقف انتشار الأسلحة النووية، تخضع لدورة الخلية الانسحاب، ويدخل في برنامج عضلي تشكيل خلايا متعددة النوى مع sarcomeres، ويشار إلى myotubes. مع الظروف الثقافة لفترات طويلة، قد myotubes يظهر خصائص مقلص و"نشل" في الثقافة. وقد جرى الآن أيضا إنشاء خطوط الخلايا البشرية 5. وبالإضافة إلى هذه خطوط الخلايا خلده، myoblasts وحيدات النوى يمكن عزلها عن العضلات وتحت ظروف مماثلة من الجوع الدم ستشكل myotubes. هذه خطوط الخلايا والثقافات بالخلايا العضلية الجذعية الأساسية هي استخدام عاليةفول لأنها يمكن أن تكون مع transfected البلازميدات أو transduced مع الفيروسات واستخدامها لدراسة العمليات البيولوجية الخلية الأساسية. ومع ذلك، هذه الخلايا، حتى عندما يسببها لتشكيل myotubes، تفتقر إلى العديد من الميزات البارزة لتنظيم العضلات ناضجة. على وجه التحديد، myotubes هي أصغر بكثير من myofibers ناضجة الفردية وتفتقر إلى الشكل الطبيعي للmyofibers. الأهم من ذلك، myotubes تفتقر عرضية (T-) الأنابيب، وشبكة غشائي اللازمة لكفاءة الكالسيوم 2+ إطلاق سراح جميع أنحاء هيولى عضلية.
طريقة بديلة لبالخلايا العضلية الجذعية الأولية أو خطوط الخلايا عضلي يستلزم استخدام myofibers ناضجة. ويمكن استخدام Transgenesis لإقامة التعبير عن البروتينات الموسومة، ولكن هذه الطريقة مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. وقد برزت في الجسم الحي Electroporation للمن العضلات الماوس بوصفه الأسلوب المفضل لسرعته والموثوقية 10/06.
طرق لفي الجسم الحي Electroporation للوالعزلة الفعالة من myofibers هكتارلقد تم تحسين للماوس الباسطة للأصابع القصيرة (FDB) في العضلات 6. الأساليب يمكن أن تكتمل بسهولة وهم الغازية الحد الأدنى للحث في التعبير المجراة من البلازميدات. يتم الجمع بين هذا النهج الآن مع أساليب التصوير عالية الدقة بما في ذلك التصوير بعد انقطاع ليزر من 6،7 غمد الليف العضلي. مزيج من الأصباغ الفلورية والتعبير عن البروتينات fluorescently المسمى يمكن استخدامها لمراقبة العمليات الحيوية في الخلية myofibers ناضجة.
هي مناسبة للاستخدام Electroporation لللدراسة البروتينات الموسومة fluorescently في الجسم الحي مثالي لدراسة العضلات نظرا لعدم وجود نماذج خط الخلية المناسبة التي تحاكي بأمانة هيكل الخلية بأكملها من العضلات. يصف هذا البروتوكول استخدام Electroporation للوعالية الدقة متحد البؤر المجهر…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS047726، NS072027، وAR052646.
DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
Clay | Electroporation | ||
Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |