Мы демонстрируем метод для анализа афлатоксинов и экспрессии трансгена в семенах арахиса, которые содержат РНК-интерференции сигналов для глушителей генов афлатоксин-синтеза в гриба Aspergillus Flavus. RNAi-опосредованной контроль микотоксинов в растениях не сообщалось ранее.
Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций оценивает, что 25% из продовольственных культур в мире заражены афлатоксинов. Это представляет 100 миллионов тонн продовольствия разрушается или направляются на потребление нечеловеческого каждый год. Афлатоксины мощные канцерогены, как правило, накопленные грибов Aspergillus Flavus и А. parasiticus в крупах, орехах, корнеплодах и других сельскохозяйственных продуктов. Подавление пяти генов афлатоксин-синтеза РНК интерференции (РНК-интерференции) в арахиса растений используется для управления накопление афлатоксина после прививки с А. Flavus. Ранее ни один метод не существовал, чтобы проанализировать эффективность РНК-интерференции в отдельных арахиса трансгенных событий, так как они, как правило, производят несколько семян и традиционных методов крупных полевых экспериментов в рамках афлатоксина-благоприятные условия были не вариант. В поле, вероятность нахождения естественно загрязненных семян часто 1/100 до 1/1,000. Кроме того, содержание афлатоксинов не распределены равномерно. Наш способ использует несколько трансгенных семян на событии, с небольшими кусочками, обработанных для ПЦР в реальном времени (RT-PCR) или небольшой РНК последовательности, и для анализа накопления афлатоксина методом жидкостной хроматографии ультра-производительности (UPLC). RNAi-экспрессирующих арахиса линии 288-72 288-74 и, показали до 100% снижения (p≤0.01) в афлатоксина В 1 и В 2 по сравнению с контролем, что накопленный до 14000 нг. Г -1 афлатоксина В1, когда засевают aflatoxigenic А. Flavus. Для справки, общий максимальный объем афлатоксинов допустимых для потребления человеком в Соединенных Штатах составляет 20 нг. Г -1. Этот протокол описывает применение РНК-интерференции-опосредованного контроля афлатоксинов в трансгенных семян и методы ее оценки арахиса. Мы считаем, что его применение в разведении арахиса и других культур принесет быстрое продвижение в этой важной области науки, Медицина и питание человека, и внесет значительный вклад в международные усилия, чтобы контролировать афлатоксины и потенциально другие микотоксины в основных продовольственных культур.
Примерно 4,5 миллиарда человек хронически подвергаются афлатоксинов 1, наиболее мощных канцерогенов, известных в природе 2. Эти микотоксины загрязняют 25% продовольственных культур в мире, в том числе 3 кукурузы, маниоки, риса, орехов, злаков и специй. 4. Афлатоксины причина задержки роста у детей 5, ослабляют иммунную систему 6, присутствуют в 58% гепатоцеллюлярной карциномы в-человека биопсии 7,8, и убить сотни людей во время периодических вспышек Афлатоксикоз 9,10. Афлатоксины поликетида полученных микотоксинов обычно производимые Aspergillus Flavus и А. parasiticus; афлатоксины В 1 и В 2 получают путем А. Flavus, в то время как А. parasiticus также производит G 1 и G 2. Химическая структура этих соединений и хроматограмме, показывая их разделение по UPLC показаны на рисунке 1. </strОнг>
Рисунок 1. Афлатоксины и РНК-интерференции вставить Топ:. Химическая структура (слева) и пример хроматограммы (справа) из четырех наиболее распространенных поликетида полученных афлатоксинов: В 1, В 2, С 1 и С 2, производится Aspergillus parasiticus, A . Flavus производит В 1 и В 2 Bottom: Схема генных фрагментов в РНК-интерференции построить p5XCAPD для арахиса трансформации, цифры под стрелы ген-фрагмент инвентарные номера в Flavus генома Aspergillus;. PIV2: картофель интрон; BP: пар оснований; RT_5X_1 и RT_5X_2:. Real-Time ПЦР праймеров сайты Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Экономические потери в экспорте из-за афлатоксинов в арахисе в одиночку превышать $ 450 млн долларов США, если рассчитывается на основе 4 нг. Г -1 предел афлатоксина разрешено для потребления человеком в Европейском союзе 11. Афлатоксины были известны в течение 60 лет 12; Однако, хотя многие сельскохозяйственные практики были разработаны, чтобы смягчить их влияние, в том числе применения других грибковых штаммов 13,14, либо последовательный способ управления не существует, и устойчивые сорта растений не доступны. Тестирование зародышевой плазмы растений на устойчивость к афлатоксинов особенно трудно, потому что даже при благоприятных условиях для патогена вторжения, микотоксинов накопление непредсказуемо и не соответствует нормальному распределению. Таким образом, эксперименты, как правило, требуют больших площадей посадки, сотни семян и нескольких образцов 100-1,700 г, чтобы уменьшить изменчивость 15,16 данных.
РНК-интерференция былаобнаружили в 1998 году 17; и преимущества "глушителей" В настоящее время изучаются в ряде новых приложений, например., в человеческих терапий против метастатическим раком молочной железы 18, рака печени 19, миелолейкоза 20, и в защите растений от насекомых и нематод 21 22. В растениях, сигналы помех РНК может путешествовать клетки к клетке, с малых интерферирующих РНК (миРНК) и высокой молекулярной массы РНК отвечать за системной посттранскрипционном гена глушителей 23,24, даже внутри грибковых патогенов, которые находятся в тесном контакте с растением-хозяином 25. Эффективность РНК-интерференции на завод-опосредованной молчания грибковых патогенов генов был описан в нескольких pathosystems растений, для них, визуальный осмотр симптомов в надземные части растения (листья) позволил количественного заболевания, т.е. оомицет Bremia в салат 26 , Puccinia в пшенице <suр> 27 и Fusarium в банан 28. Гораздо сложнее оценить RNAi эффективность для контроля микотоксинов в растениях, в частности афлатоксины в арахисе, как листья не показывают никаких признаков инфекции, органы вторглись (семена) находятся под несколькими дюймами почвы, возникновение инфекции является непредсказуемым, и только химический Анализ может определить наличие афлатоксинов. Кроме того, каждый трансгенной событие арахиса обычно производит несколько семян (4-6 на растение); Поэтому традиционные испытания на нет-афлатоксина накопления признака в больших полевых участках, прочного весь обрезки сезонов, и, используя сотни семян не представляется возможным. Способ описан здесь анализировать менее одной недели, РНК-интерференции семена арахиса для присутствия трансгена и для не-афлатоксина накопления признака, используя только несколько семян.
Завод-хост RNAi-обеспечиваемого молчания генов в патогенных грибов было продемонстрировано 27,43, однако, нет публикаций, показывающие возможность RNAi-опосредованной контроля микотоксинов накопления в растениях. Один ограничивающим фактором для этих исследований в арахиса было отсутствие метода оценки не-афлатоксина накопления фенотип в отдельных растений, а листья не показывают симптомов при грибковой инфекции подземных контейнеров. Кроме того, не-нормально распределена накопления афлатоксинов, и потребность в больших выборках для химического анализа 15,16 препятствовали количественно потенциального эффекта РНК-интерференции на одном заводе. Метод, представленный здесь, состоит из 72 ч экспериментов с использованием пяти семена, чтобы выполнить три 24 ч интервал выборки в трех экземплярах (таблица 1, рисунок 7). По сравнению с типичной анализа афлатоксина, который требует не менее 100 г семян, наш метод особенно подходит для индивидамил трансгенные события арахиса растений, которые изначально не производят не более двух или трех стручков.
РНК-опосредованного молчание синтеза афлатоксина была продемонстрирована генетически трансформации Aspergillus Flavus и A. parasiticus. Так AFLR является основным регулятором производства афлатоксина в А. Flavus и А. parasiticus 44,45, он становится интересным объектом для РНК-опосредованного молчания в растениях. Тем не менее, генетические вариации в AFLR было показано среди Aspergillus видов 46, и эти генетические варианты могли избежать, если заглушить нет идеально совпадающей последовательности с сигналом RNAi, полученного в растения-хозяина. Таким образом, AFLR был одним из мишеней для глушителей в векторном p5XCAPD, но не был единственным. Инвертированных повторов гена AFLR, внесенные в А. Flavus и А. parasiticus путем преобразования привели к глушителей и минимальным или нет продуктионный афлатоксинов 47 (McDonald и др., 2005b). Кроме того, глушителей AFLD ген предотвратить производство афлатоксина до 98% в А. Flavus и А. parasiticus в прямом преобразовании 48. Для повышения вероятности успеха в нашей системе, арахисовое трансформировали инвертированный повтор фрагментов пяти генов, участвующих в производстве афлатоксина в А. Flavus. Здесь показано, что использование p5XCAPD, что цели для глушителей несколько генов в синтез афлатоксина пути, 90% -100% более низкие уровни афлатоксина B 1 и B 2 были достигнуты в соответствии 288-72 и 60-100% более низкие уровни, накопленный в Линия 288-74 по сравнению с контролем, когда половина семядоли были засеянной А. Flavus, цифры 4, 7. Самое главное, этот метод обнаружено статистически значимых различий в накоплении афлатоксина от линий 288-72 288-74, против контроля на протяжении всего эксперимента с применением параметрического STATISтики, Рисунок 7. Учитывая небольшой размер выборки, важно подчеркнуть необходимость использования мощного метода для обнаружения афлатоксины, эти эксперименты были проанализированы с помощью UPLC который имеет высокое разрешение, в пять раз более высокую производительность и в три раза более высокую чувствительность, чем ВЭЖХ 49.
Экспрессия РНК-интерференции вставки в 288-74 был обнаружен только в незрелых семядолей (желтый) в 24 ч инкубации. Вставка РНК-интерференции не обнаруженные RT-PCR на зрелых семядолей 288-74 на 24 часов, или на любом погашения группы в 48 ч, на рисунке 6. Это же явление наблюдалось и в других РНК-интерференции трансгенных линий арахиса (Arias, RS, 2015 неопубликованные), где обычно RNAi стенограммы были обнаружены только на незрелых семядолей на 24 часов. Образцы РНК обрабатывали ДНКазой перед синтеза кДНК, данные были нормированы на уровень экспрессии актина и без признаков контаминации ДНК наблюдалось. Должен ДНК были присутствовать в образцах, он долженбыли обнаружены в образцах ч 48, а также, но последовательно, что было не так. Выражение под контролем 35S промотора не всегда равномерное; это может повлиять на условия окружающей среды 50, типа ткани и стадии развития 51,52. В то же время, в пути РНК-интерференции, скорость распада мРНК и скорость распада миРНК может значительно варьироваться в зависимости 53. Вполне возможно, что быстрое ухудшение мРНК по механизму РНК-интерференции могло бы предотвратить обнаружение мРНК на 48 ч инкубации. Будь отсутствие экспрессии на 48 часов было связано с низким 35S-промотора приводом транскрипции, или быстрой деградации дцРНК по Dicer остается без ответа. Таким образом, обнаружение малых РНК высокой пропускной последовательности даст лучшее представление о процессах, происходящих через РНК-интерференции 54 В этих экспериментах. Однако, поскольку РНК молчание распространяется системно, в основном, через флоэмы от photosyntненавижу источники сахарозу раковины (в этом случае арахиса семян) 55, замалчивание афлатоксина-синтеза может произойти в семенах без местного выражения RNAi вставки. Много исследований еще предстоит сделать, чтобы определить пороговый уровень малых интерферирующих РНК (миРНК), необходимых для предотвращения накопления афлатоксина в семенах. Важно подчеркнуть тот факт, что оба, экспрессия мРНК в РНК-интерференции построить (рисунок 6), и накопление афлатоксин B 1 и B 2 (рис 7) показали разные результаты для незрелых (желтый) против. зрелая (коричневый) семядоли. Арахис растения имеют неопределенный рост, то есть, они представляют во время сбора урожая в диапазоне от погашения стручки, рис 2. Кроме того, семена из разных групп зрелости отличаются по своему химическому составу., Например, 2,4% сахарозы в незрелых семян, а 1,9% в зрелые семена под одной полевых условиях. 56,57 Таким образом, чтобы понять фактическое efficiencу РНК-опосредованного контроля накопления афлатоксина, важно, чтобы проанализировать группы отдельно зрелости.
Естественный защита семян арахиса является производство фитоалексинов, которая меняется в многообразии соединений, полученных и их относительных величин, в зависимости от зрелости семян и условий окружающей среды 58-61, и это особенно выше у эмбрионов по сравнению с семядолей 62. Эмбрионы также значительно более высокие концентрации нуклеиновых кислот, ДНК и РНК, чем семядолей (Arias RS, неопубликованных). Как семена арахиса созревают, изменения в их физиологии и химического состава происходит 63. Фенольные антиоксиданты в форме арахиса теста конденсированных дубильных веществ с фунгистатическим деятельности; 64 это очевидно в мезокарпий цвета, который отражает погашения этапы, желтые черный 35, а его содержание дубильных веществ и фенольных соединений увеличивается с зрелости 65. Таким образом, наличие тТелепрограм или эмбрионов в эксперименте, с учетом их антимикробные свойства, мог бы ограничен рост грибков и, следовательно, трудно переоценить эффект RNAi молчания, следовательно, они были удалены. Кроме того, удаление кожуры и эмбрионов помогает ограничить источники вариации в анализе, как половина семядолей, который несет зародыш будет больше и больше фитоалексинов содержание РНК.
В дополнение к анализу зрелости групп и удаление семенной кожуры и зародыша в этих экспериментах, важно отметить, несколько наблюдений: а) если результаты приведены в течение 96 ч инкубации, рекомендуется использовать не более чем на 72 ч, чтобы получить достоверные результаты, так как семена получают разрушается 96 часов; и б), тогда как половина семядоли из того же семени, хотя пробы случайным образом, не являются идеально независимых выборок, ОТ-ПЦР и накопление афлатоксина в трансгенных событий показал минимальную вариацию между семенами. Кроме того, рассчитывать точное грибковые споры, объем посевнойс 2 мкл, и применение спор на поверхности среза семядолей избегая капает по бокам важны, чтобы убедиться, проросшие споры подвергаются ткани растений. Вода / агар на пластинах должны быть на уровне 1,5% (вес / объем), более мягкий агар вызывает сток спор, как показано на последнем кадре, показанном на фиг.4 (внизу). Если семена наличие от конкретного трансгенного случае ограничивается, выборка может быть сделано в двух экземплярах вместо тройных получения аналогичными результатами (например, рисунок 7); Однако три образца поможет уменьшить стандартную ошибку. Единственное ограничение этого метода является то, что он требует очень чувствительная система (UPLC) для обнаружения афлатоксин / количественного, но в то же время это уменьшает вероятность переоценить влияние РНК-интерференции должны афлатоксины не обнаружено менее чувствительных методов.
В заключение, этот метод предлагает впервые надежный подход для изученияЭффект РНК-интерференции в контроле афлатоксинов. Сокращение времени для эксперимента из всей посевной сезон до менее чем за одну неделю, этот метод будет чрезвычайно ускорить исследования по РНК-интерференции арахиса / Aspergillus pathosystem к смягчению и / или устранению афлатоксинов.
The authors have nothing to disclose.
This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.
Primers, oligonucleotides | DNA Technologies, Coralville, IA, USA | n/a | |
Dneasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69106 | |
Czapek Dox agar medium | Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | CM0095 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | BP 1423 | |
Freezer -80°C | n/a | n/a | |
Aluminum Oxide, Al2O3 | Fisher Scientific | A941 | |
SPE Reservoirs 1.5 mL | Grace Davison Discovery Scientific | 210011 | |
Frits for 1.5 mL SPE reservoir | Grace Davison Discovery Scientific | 211401 | |
Autosampler vials | Waters Corporation, Milford, MA | 186005221 | |
Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column | Waters Corporation, Milford, MA | ||
Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software | Thermo Electron Corp., San Jose, CA | ||
Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A6636; A9887; A0138; A0263 | |
Systat Software 12.2 | SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA | ||
Trizol reagent | Invitrogen, CA | 15596-018 | |
SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix | Invitrogen, CA | 11752-050 | |
ABI 7500 Real-Time PCR | Lifetechnologies, Grand Island, NY | 4406984 | |
Luria Broth-Miller | Fisher Scientific | R453642 | |
pENTR1A | Invitrogen, CA | A10462 | |
LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-020 | |
T4 DNA Ligase | NEB Biolabs | M0202L | |
Gelrite | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1919 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406 | |
QIAcube robot workstation | Qiagen, Valencia, CA | 9001292 | |
Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin | Goldbio, St. Louis, MO | cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, CA | 11304-029 |