Nós demonstramos um método para a análise de aflatoxinas e a expressão do transgene em sementes de amendoim que contêm sinais de ARN de interferência para silenciar genes aflatoxina-síntese no fungo Aspergillus flavus. Controlo mediada por ARNi de micotoxinas em plantas não foi reportado anteriormente.
A Organização para a Alimentação e Agricultura das Nações Unidas estima que 25% das lavouras de alimentos do mundo estão contaminados com aflatoxinas. Isso representa 100 milhões de toneladas de alimentos a ser destruídos ou desviados para consumo não humano a cada ano. As aflatoxinas são substâncias cancerígenas poderosos normalmente acumulados pelos fungos Aspergillus flavus e A. parasiticus em cereais, nozes, tubérculos e outros produtos agrícolas. O silenciamento de genes cinco aflatoxina-síntese através de interferência de RNA (RNAi) em plantas de amendoim foi usada para controlar a acumulação de aflatoxina a seguir à inoculação com A. flavus. Anteriormente, existia nenhum método para analisar a eficácia de RNAi em eventos transgênicos amendoim indivíduo, uma vez que estes geralmente produzem poucas sementes e os métodos tradicionais de grandes experimentos de campo em condições de aflatoxinas-propício não foram uma opção. No campo, a probabilidade de encontrar sementes naturalmente contaminadas é muitas vezes 1/100 a 1/1,000. Além disso, a contaminação por aflatoxinas não é uniformemente distribuída. O nosso método utiliza algumas sementes por modificação genética, com pequenos pedaços processados para PCR em tempo real (RT-PCR) ou pequena sequenciação de ARN, e para a análise da acumulação de aflatoxinas por cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC). Linhagens de amendoim expressando RNAi 288-72 e 288-74, mostrou redução de até 100% (p≤0.01) em aflatoxina B 1 e B 2 em comparação com o controle que acumulou até 14.000 ng. G -1 de aflatoxinas B 1, quando inoculadas com A. aflatoxigênicos flavus. Como referência, o total máximo de aflatoxinas permitidos para consumo humano nos Estados Unidos é de 20 ng g -1.. Este protocolo descreve a aplicação do controlo mediado por RNAi de aflatoxinas em sementes de amendoim transgénicos e métodos para a sua avaliação. Acreditamos que a sua aplicação no melhoramento de amendoim e outras culturas trará rápido avanço nesta importante área da ciência, Medicina e nutrição humana, e irá contribuir significativamente para o esforço internacional para controlar aflatoxinas e, potencialmente, outras micotoxinas nos principais culturas alimentares.
Cerca de 4,5 bilhões de pessoas estão cronicamente expostos a aflatoxinas 1, os agentes cancerígenos mais poderosas conhecidas na natureza 2. Estas micotoxinas contaminam 25% das culturas alimentares no mundo 3, incluindo milho, mandioca, arroz, nozes, cereais e especiarias. 4. As aflatoxinas causam raquitismo em crianças de 5, prejudicar o sistema imunológico 6, estão presentes em 58% dos carcinomas hepatocelulares-em biópsias humanos 7,8, e matar centenas de pessoas durante os surtos periódicos de aflatoxicosis 9,10. As aflatoxinas são micotoxinas derivadas de polic�ido normalmente produzidas por Aspergillus flavus e A. parasiticus; aflatoxinas B 1 e B 2 são produzidos por A. flavus, enquanto A. parasiticus também produz L 1 e L 2. A estrutura química destes compostos e um cromatograma que mostra a separação por UPLC são mostrados na Figura 1. </strong>
Figura 1. As aflatoxinas e RNAi inserir Top:. Estrutura química (esquerda) e exemplo de cromatograma (à direita) dos quatro aflatoxinas derivados de polic�ido mais comuns: B 1, B 2, G 1 e G 2, produzida por Aspergillus parasiticus, A . flavus produz B 1 e B 2 inferior: Esquema de fragmentos de genes no RNAi construir p5XCAPD utilizado para transformação de amendoim, números sob setas são números de genes-fragmento de adesão no genoma Aspergillus flavus;. PIV2: intrão de batata; pares de bases;: pb RT_5X_1 e RT_5X_2:. Real-Time PCR locais iniciadores Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Sozinho perdas econômicas nas exportações devido a aflatoxinas em amendoim ultrapassar US $ 450 milhões de dólares norte-americanos, se calculado com base no 4 ng. G -1 limite de aflatoxina permitidos para consumo humano na União Europeia 11. As aflatoxinas são conhecidos há 60 anos 12; no entanto, embora muitas práticas agrícolas foram desenvolvidos para mitigar seus efeitos, incluindo a aplicação de outras cepas fúngicas 13,14, nenhum método coerente de controlo existe, e variedades de plantas resistentes não estão disponíveis. Teste de germoplasma de plantas para resistência a aflatoxinas é particularmente difícil, porque mesmo sob condições propícias para a invasão do patógeno, a acumulação de micotoxinas é imprevisível e não segue uma distribuição normal. Assim, as experiências geralmente requerem grandes áreas de plantação, centenas de sementes e várias amostras de 100-1,700 g para reduzir a variabilidade de dados a 15,16.
Interferência de ARN foidescobriram em 1998 17; e os benefícios de "silenciar" estão actualmente a ser explorada em uma série de novas aplicações, por exemplo., em terapias humanas contra o câncer de mama metastático 18, câncer de fígado 19, leucemia mielóide 20, e na protecção das plantas contra insetos e nematóides 22 21. Nas plantas, sinais de interferência de RNA pode viajar uma célula para outra, com pequeno RNA de interferência (siRNA) e RNA de elevado peso molecular sendo responsável pelo pós-transcricional gene silenciamento sistêmica 23,24, mesmo dentro de fungos patogénicos que estão em contato próximo com planta hospedeira 25. A eficácia do RNAi na silenciamento mediado por planta de genes de fungos-patógeno foi descrito em alguns patossistemas de plantas, para estes, exame visual dos sintomas na parte aérea das plantas (folhas) permitiu a quantificação da doença, ou seja, oomiceto Bremia em alface 26 , no trigo Puccinia <sup> 27 e Fusarium em 28 de banana. Muito mais difícil é para avaliar a eficácia de ARNi para controlar micotoxinas em plantas, particularmente as aflatoxinas em amendoins como as folhas não apresentam sintomas de infecção, os órgãos invadidos (sementes) estão sob várias polegadas de solo, a ocorrência de infecção é imprevisível, e apenas química análise pode determinar a presença de aflatoxinas. Além disso, cada evento transgênico no amendoim normalmente produz poucas sementes (4-6 por planta); Portanto, o teste tradicional para um não-acumulação de aflatoxina traço em grandes parcelas de terreno, com duração de safras inteiras, e usando centenas de sementes não é viável. É descrito um método para analisar aqui em menos de uma semana, de ARNi sementes de amendoim para a presença de transgene e para um não-aflatoxina acumulação traço, usando apenas poucas sementes.
Planta-hospedeiro RNAi mediada por silenciamento de genes em fungos patogénicos foi demonstrada 27,43, no entanto, não existem publicações que mostram a viabilidade do controlo de RNAi mediada por acumulação de micotoxinas em plantas. Um factor limitante para estes estudos em amendoim foi a falta de um método para avaliar um não-aflatoxina fenótipo acumulação em plantas individuais, como as folhas não apresentam sintomas após infecção fúngica das vagens subterrâneas. Além disso, o acúmulo de não-normalmente distribuídos de aflatoxinas, ea necessidade de grandes amostras para análise química 15,16 dificultaram a quantificação do potencial efeito RNAi em uma única planta. O método aqui apresentado consiste em 72 experiências de RH utilizando cinco sementes para executar três amostragens de 24 horas de intervalo, em triplicado (Tabela 1, Figura 7). Em comparação com a análise típica aflatoxina que requer não menos do que 100 g de sementes, o nosso método é particularmente adequado para individuaL eventos transgénicas de plantas de amendoim que inicialmente não produzem mais do que dois ou três vagens.
Silenciamento mediado ARN-síntese de aflatoxina foi demonstrada por transformar geneticamente Aspergillus flavus e A. parasiticus. Desde AFLR é um regulador principal de produção de aflatoxinas em A. flavus e A. parasiticus 44,45, torna-se um alvo interessante para o silenciamento mediado ARN em plantas. No entanto, variações genéticas nos AFLR foram mostrados entre espécies Aspergillus 46, e essas variantes genéticas poderiam escapar silenciamento se não existe uma sequência perfeita correspondência com o sinal de ARNi produzido no hospedeiro planta. Assim, AFLR foi um dos alvos para silenciar no vetor p5XCAPD, mas não foi o único. Repetições invertidas do gene AFLR introduzidos A. flavus e A. parasiticus por transformação resultou em silenciar e mínimo ou nenhum produtoion de aflatoxinas 47 (McDonald et al., 2005b). Além disso, o silenciamento do gene Afld impedido a produção de aflatoxina em até 98% em A. flavus e A. parasiticus em transformação direta 48. Para aumentar a probabilidade de sucesso no nosso sistema, de amendoim foi transformada com fragmentos de repetição invertida de cinco genes envolvidos na produção de aflatoxinas em A. flavus. Aqui mostra-se que o uso de p5XCAPD que tem como alvo para silenciar vários genes na via de síntese de aflatoxina, 90% -100% de níveis mais baixos de aflatoxina B 1 e B 2 foram obtidos de acordo 288-72, e níveis mais baixos de 60-100% em acumulada A linha 288-74 em comparação com o controlo, quando cotilédones meio foram inoculados com A. flavus, as Figuras 4, 7. Mais importante ainda, este método detectou diferenças estatisticamente significativas na acumulação de aflatoxina por linhas 288-72, 288-74 contra o controle durante o experimento, aplicando statis paramétricotiques, a Figura 7. Dado o pequeno tamanho da amostra, é importante destacar a necessidade de usar um método poderoso para detectar aflatoxinas, estas experiências foram analisadas por UPLC que tem uma alta resolução, cinco vezes maior desempenho e três vezes maior sensibilidade do que HPLC 49.
Expressão da RNAi inserção em 288-74 só foi detectada em cotilédones imaturos (amarelo) em 24 horas de incubação. A inserção RNAi não foi detectado por RT-PCR em cotilédones maduros de 288-74 às 24 horas, ou em qualquer grupo de maturação em 48 horas, a Figura 6. Este mesmo fenômeno foi observado em outras linhas de amendoim transgênicas de RNAi (Arias, RS, 2015 não publicado), onde normalmente transcritos de ARNi foram detectadas apenas em cotilédones imaturos às 24 h. As amostras de RNA foram tratadas com DNase antes da síntese de ADNc, os dados foram normalizados para o nível de expressão de actina e nenhuma evidência de contaminação do ADN foi observada. No caso de o ADN ter estado presente nas amostras, que deveriaforam detectados nas amostras de 48 h, bem como, de forma consistente, mas que não foi o caso. A expressão sob o controlo do promotor 35S-nem sempre é uniforme; ele pode ser afetada pelas condições ambientais 50, tipo de tecido e estágio de desenvolvimento 51,52. Ao mesmo tempo, na via de interferência de ARN, a taxa de decaimento do mRNA e a taxa de decaimento siARN pode variar significativamente 53. É possível que a rápida degradação do ARNm por o mecanismo de interferência de ARN poderia ter evitado a detecção de ARNm de 48 horas de incubação. Se a ausência de expressão em 48 horas foi devido a baixa 35S-promotor impulsionado transcrição, ou a degradação rápida de dsRNA por Dicer continua a ser respondida. Assim, a detecção de pequenos RNAs de alto rendimento de sequenciamento daria uma melhor visão sobre os processos que ocorrem por meio de RNAi 54 Nestas experiências. No entanto, desde RNA silenciamento espalha sistemicamente, principalmente através do floema de photosyntodeio fontes à sacarose pias (neste caso, amendoim sementes) 55, o silenciamento de aflatoxina-síntese pode ocorrer em sementes sem expressão local do RNAi inserção. Muita pesquisa ainda precisa ser feito para determinar o nível de limiar de pequenos RNAs de interferência (siRNAs) necessários para evitar a acumulação de aflatoxina em sementes. É importante ressaltar o fato de que ambos, a expressão do mRNA do RNAi construir (Figura 6), ea acumulação de aflatoxinas B 1 e B 2 (Figura 7) apresentaram resultados diferentes para imaturo (amarelo) vs. madura (marrom) cotilédones. Plantas de amendoim têm crescimento indeterminado, isto é, eles apresentam no momento da colheita de uma gama de vagens de maturidade, Figura 2. Além disso, as sementes a partir de diferentes grupos de maturação diferem na sua composição química, por ex., 2,4% de sacarose nas sementes imaturas, e 1,9% em sementes maduras, nas mesmas condições de campo 56,57. Assim, para entender a efic realy de controlo mediada por ARN-acumulação de aflatoxina, é importante analisar separadamente grupos de maturação.
A defesa natural de sementes de amendoim é a produção de fitoalexinas, que varia na diversidade de compostos produzidos e suas quantidades relativas, dependendo da maturidade das sementes e das condições ambientais 58-61, e é particularmente maior em embriões em comparação com 62 cotilédones. Os embriões também têm concentrações significativamente maiores de ácidos nucleicos, tanto DNA e RNA do que os cotilédones (RS Arias, não publicados). Como sementes de amendoim amadurecer, mudanças em sua fisiologia e composição química ocorrer 63. Antioxidantes fenólicos em forma de amendoim testa taninos condensados com atividade fungistática 64; este é também evidente na cor mesocarpo que reflete estágios de maturidade, amarelo para preto 35, como o seu teor de taninos e compostos fenólicos aumenta com a maturidade de 65. Assim, a presença de tESTA ou embriões no experimento, dadas as suas propriedades antimicrobianas, pode ter limitado o crescimento de fungos e, portanto, sobrestimada o efeito de silenciamento de RNAi, por conseguinte, eles foram removidos. Além disso, a remoção dos embriões Testa e ajuda a limitar as fontes de variação na análise, como a metade cotilédone que transporta o embrião terá mais fitoalexinas e mais conteúdo de RNA.
Em adição à análise por grupos de maturação e remoção do tegumento e embrião nestas experiências, é importante salientar mais algumas observações: a) embora os resultados são mostrados por até 96 horas de incubação, é recomendado o uso de não mais do que 72 hr para obter resultados consistentes, como sementes se degradado por 96 horas; e b) Considerando cotilédones meia da mesma semente, embora selecionadas aleatoriamente, não constituem amostras perfeitamente independentes, RT-PCR e acumulação de aflatoxina dentro de eventos transgênicos mostrou pouca variação entre as sementes. Além disso, contar um esporo do fungo precisa, volume de inóculoS de 2 mL, e a aplicação de esporos sobre a superfície de corte dos cotilédones evitando gotejamento sobre os lados são importantes para assegurar que os esporos germinados são expostos para o tecido da planta. A água / agar nas placas deve ser de 1,5% (w / v), mais macio faz com que o escoamento de agar de esporos, como mostrado no último quadro da Figura 4 (em baixo). Deve disponibilidade semente transgénica a partir de um evento especial, ser limitado, a amostragem pode ser feita em duplicado em triplicado, em vez de se obterem resultados semelhantes (ou seja, Figura 7); no entanto, as amostras em triplicado vai ajudar a reduzir o erro padrão. A única limitação deste método é que ele exige um sistema altamente sensível (UPLC) para a detecção de aflatoxina / quantificação, mas, ao mesmo tempo que reduz a probabilidade de sobrestimar o efeito de RNAi deve aflatoxinas não ser detectado por meio de métodos menos sensíveis.
Em conclusão, este método oferece pela primeira vez um método fiável para estudar oefeito de RNAi no controlo das aflatoxinas. Reduzindo o tempo para uma experiência de uma safra inteira para menos de uma semana, este método irá tremendamente acelerar a investigação sobre RNAi-amendoim / Aspergillus patossistema para a mitigação e / ou eliminação de aflatoxinas.
The authors have nothing to disclose.
This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.
Primers, oligonucleotides | DNA Technologies, Coralville, IA, USA | n/a | |
Dneasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69106 | |
Czapek Dox agar medium | Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | CM0095 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | BP 1423 | |
Freezer -80°C | n/a | n/a | |
Aluminum Oxide, Al2O3 | Fisher Scientific | A941 | |
SPE Reservoirs 1.5 mL | Grace Davison Discovery Scientific | 210011 | |
Frits for 1.5 mL SPE reservoir | Grace Davison Discovery Scientific | 211401 | |
Autosampler vials | Waters Corporation, Milford, MA | 186005221 | |
Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column | Waters Corporation, Milford, MA | ||
Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software | Thermo Electron Corp., San Jose, CA | ||
Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A6636; A9887; A0138; A0263 | |
Systat Software 12.2 | SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA | ||
Trizol reagent | Invitrogen, CA | 15596-018 | |
SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix | Invitrogen, CA | 11752-050 | |
ABI 7500 Real-Time PCR | Lifetechnologies, Grand Island, NY | 4406984 | |
Luria Broth-Miller | Fisher Scientific | R453642 | |
pENTR1A | Invitrogen, CA | A10462 | |
LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-020 | |
T4 DNA Ligase | NEB Biolabs | M0202L | |
Gelrite | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1919 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406 | |
QIAcube robot workstation | Qiagen, Valencia, CA | 9001292 | |
Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin | Goldbio, St. Louis, MO | cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, CA | 11304-029 |