我们证明了包含RNA干扰信号沉默中黄曲霉毒素合成基因真菌黄曲霉黄曲霉毒素的转基因表达的花生种子的分析方法。真菌毒素的植物中RNAi介导的控制以前没有被报道。
联合国粮食和农业组织估计,粮食作物在世界上25%的污染黄曲霉毒素。表示亿吨食物被破坏或每年改行非人类消费。黄曲霉毒素是致癌物质强大通常由真菌黄曲霉和寄生 A.谷物,坚果,块根作物等农产品积累。五黄曲霉毒素合成基因在植物花生RNA干扰(RNAi)沉默使用以下接种以 A来控制黄曲霉毒素积累菌 。以前,没有方法存在来分析的RNAi在个别花生转基因事件的有效性,因为这些通常会产生黄曲霉毒素有利的条件下几个种子,和传统的大视场实验方法进行了不是一个选项。在该领域,寻找自然污染的种子的概率是经常1/100至1/1,000。另外,黄曲霉毒素污染是不均匀分布的。我们的方法使用每个转基因事件的种子数,以处理用于实时PCR(RT-PCR)小块或小RNA测序,和黄曲霉毒素的积累通过超高效液相色谱(UPLC)分析。的RNAi表达花生线288-72和288-74,显示出高达100%的减少(P≤0.01)中黄曲霉毒素B 1和B 2相比,累加到14000纳克控制。克黄曲霉毒素1时-1接种是否产A.菌 。作为参考,最大总黄曲霉毒素的允许供人食用的在美国为20纳克。克-1。本协议描述的黄曲霉毒素的转基因花生种子和其评价方法RNAi介导的控制中的应用。我们相信,它在花生等作物的育种中的应用将带来快速的进步在科学这一重要领域,医学和人体营养,而且会显著促进国际努力控制黄曲霉毒素,以及潜在的其他真菌毒素的主要粮食作物。
约4.5十亿人长期接触黄曲霉毒素1,在大自然2已知最强大的致癌物质。这些真菌毒素污染的粮食作物的25%的世界3,包括玉米,木薯,大米,坚果,谷类和香料。4。黄曲霉毒素导致发育迟缓的儿童5,损害免疫系统 6,存在于肝细胞,癌58%的人活检7,8,并在对黄曲霉毒素中毒9,10周期性爆发杀死数百人。黄曲霉毒素是通常由黄曲霉菌 和 A.生产的聚酮化合物来源的霉菌毒素寄生 ;黄曲霉毒素B 1和B 2是由 A.产生黄曲霉 ,而A.寄生还生产G1和G2 2。这些化合物和一个色谱图,显示它们的分离通过UPLC的化学结构示于图1。 </str翁>
图1. 黄曲霉毒素和RNAi插入 顶部 :四种最常见的聚酮化合物衍生黄曲霉毒素的化学结构(左)和例子色谱图(右):B 1,B 2,G 1和G 2, 寄生曲霉 , 所生产的。 黄曲霉产生B 1和B 2底部 :示意图中所述RNAi基因片段的构建p5XCAPD用于花生变换,下箭头号在黄曲霉基因组基因片段的登录号。 PIV2:马铃薯内含子;沸点:碱基对; RT_5X_1和RT_5X_2:实时荧光定量PCR引物网站请点击此处查看该图的放大版本。
在出口因花生黄曲霉毒素的经济损失就超过$ 4.5亿美元如果基于4计算纳克例 -1黄曲霉毒素的限制允许用于人类消费在欧盟11。黄曲霉毒素已经知道60年12;然而,尽管许多农业实践的开发是为了减轻其影响,包括应用程序的其他真菌菌株13,14,控制没有一致的方式存在,抗性植物品种不具备的。测试植物种质的抗黄曲霉毒素是特别困难的,因为即使在病原体入侵有利的条件,毒素积累是不可预测的,不符合正态分布。因此,实验通常需要大面积种植,数百种子和100-1,700克多个样本以减小数据15,16的可变性。
RNA干扰是发现于1998年17;和“沉默”的好处目前正在探讨在许多新的应用,例如,在针对转移性乳腺癌18,肝癌19,粒细胞性白血病20,和在植物保护,防止昆虫21和线虫22人类疗法。在植物中,RNA干扰信号可行驶细胞与细胞,小干扰RNA(siRNA)和高分子量的RNA负责全身转录后基因沉默23,24,甚至内部真菌病原体是与植物宿主25紧密接触。 RNAi对真菌病原体的基因植物介导的沉默的有效性已经在几个植物pathosystems了说明,对于这些,在植物(叶)的地上部分症状目视检查允许病量化, 即 ,卵菌Bremia莴苣26 , 锈病小麦<suP> 27和枯萎的香蕉28。更加困难的是评估RNAi的有效性来控制霉菌毒素的植物,特别是黄曲霉毒素在花生的叶子表明没有感染症状,侵入(种子)的器官是下几英寸的土壤,感染的发生是不可预知的,只有化学分析可确定的黄曲霉毒素的存在。此外,在花生每个转基因事件通常会产生一些种子(4-6每株植物);因此,传统的测试无黄曲霉毒素积累特征在大视场地块,持续整个收获季节,用上百种的是不可行的。一种方法,在此描述不到一周来分析,RNA干扰花生种子转基因的存在和用于无黄曲霉毒素积累性状,只用几个种子。
植物宿主RNAi介导的基因在真菌病原体的沉默已证明27,43,但是,也有没有出版物示出在植物中真菌毒素积累的RNAi介导的控制的可行性。这些研究花生的一个限制因素是缺乏以评估个别植株无黄曲霉毒素积累型的方法,因为叶出示附有地下荚真菌感染没有症状。此外,黄曲霉毒素的不正态分布积累,以及需要大的样本,进行化学分析15,16阻碍潜在的RNAi效应的定量上的单个植物。这里介绍的方法包括使用五个种子进行一式三份3 24小时间隔取样(表1, 图7)72小时实验。相比典型的黄曲霉毒素分析,无需小于100g的种子,我们的方法是特别适合于individua花生植物最初产生不超过两个或三个荚多个升转基因事件。
黄曲霉毒素合成的RNA介导的沉默已证明通过遗传转化黄曲霉 和 A. 寄生 。因为aflR是黄曲霉毒素的产生在A的主调节器黄曲霉及 寄生 44,45,就变成为在植物中的RNA介导的沉默一个有趣的目标。然而,遗传变异aflR已经显示曲霉种 46之间,而这些基因变异可能逃脱沉默如果没有完美的序列与在植物宿主中产生的RNAi的信号相匹配。因此,aflR是对沉默的载体p5XCAPD的目标之一,但不是唯一的一个。该aflR基因引入A.反向重复序列黄曲霉及 寄生通过转化导致沉默和最小或没有产品黄曲霉毒素47的离子(McDonald等。,2005年b)。另外,沉默AFLD基因防止黄曲霉毒素产量高达98% 在 A中黄曲霉及 寄生在直接转化48。为了增加在我们的系统中的成功的概率,花生转化用5个基因参与黄曲霉毒素生产A中反向重复片段菌 。这表明,使用p5XCAPD靶向用于沉默的几个基因在黄曲霉毒素合成途径,90%黄曲霉毒素B 1和B 2的下部-100%水平在线路288-72实现的,和较低的60-100%的水平积累线288-74与对照相比,当半子叶接种A.黄曲霉, 图4,图7,最重要的是,这种方法检测由线288-72,288-74 与控制整个实验中的黄曲霉毒素积累统计学显著差异通过应用参数统计的抽动, 图7。鉴于小样本大小,它以强调需要使用功能强大的方法来检测黄曲霉毒素,这些实验是由UPLC具有高的分辨率,5倍高的性能和比灵敏度高三倍分析是很重要的HPLC 49。
RNA干扰的表达插在288-74未成熟子叶(黄色),在24小时培养才被发现。通过RT-PCR在24小时未检测到对288-74成熟子叶所述RNAi插入件,或在任何成熟组在48小时, 图6,这同样的现象中观察到的RNAi其他转基因花生线(阿里亚斯,RS,2015未公布),其中只在24小时检测未成熟子叶通常RNAi的成绩单。 RNA样品与cDNA合成之前DNA酶处理后,数据标准化为肌动蛋白表达的水平,也没有证据DNA污染进行了观察。如若DNA已在样品中一直存在,它应该在48小时的样品中被检测为好,但始终事实并非如此。在35S启动子的控制下表达并不总是均匀的;它可受环境条件50,组织和发育阶段51,52的类型。与此同时,在RNA干扰的通路,mRNA降解的速率和siRNA衰减率可以显著53有所不同。这可能是与mRNA的RNA干扰的机构的快速降解可能阻止mRNA的检测在48小时温育。无论是在缺席48小时的表达是由于低35S启动子驱动的转录,或双链RNA被Dicer快速降解有待回答的问题。因此,检测的小RNA高通量测序将使通过RNA干扰54发生的过程更好地了解 在这些实验中。然而,由于RNA沉默扩散全身,主要是通过从photosynt韧皮部讨厌源蔗糖汇(在这种情况下,花生种子)55,黄曲霉毒素合成的沉默可以发生在种子未经所述RNAi的局部表达插入物。很多研究工作要做,以确定需要防止黄曲霉毒素积累在种子小干扰RNA(siRNA)的阈值水平。必须强调的事实,即,mRNA的所述RNAi的表达构建(图6)是重要的,和黄曲霉毒素B 1和B 2(图7)的累加结果显示不同的结果为未成熟(黄色)与。成熟(棕色)子叶。花生植物具有无限生长,也就是说,它们提出在收获的范围成熟荚果的, 图2,另外,从不同的成熟群体的种子会有不同的化学组合物,例如,2.4%的蔗糖在未成熟的种子,和1.9%在同场的条件56,57成熟种子。因此,要了解实际efficienc黄曲霉毒素积累的RNA介导的控制Y,分别分析成熟群体是重要的。
花生种子的天然防御是生产植物抗毒素,而变化所产生的化合物和它们的依赖于种子和环境条件58-61的成熟相对量的多样性,并且特别在更高的胚胎相比子叶62。胚胎也有显著较高浓度的核酸,DNA和RNA比子叶(Arias的RS,未发表)。由于花生种子成熟,改变他们的生理和化学成分发生63。酚类抗氧剂花生种皮形式缩合单宁具有抑菌活性的64;这也是在中果皮颜色反映成熟期,黄色到黑色35显而易见的,如单宁酸和酚类化合物的其内容与成熟65增大。因此,存在的t埃斯塔或在实验胚胎,由于其抗微生物性质,可能具有有限的真菌的生长,因此高估的RNAi沉默的作用,因此,它们被拆除。此外,去除种皮和胚胎有助于限制中的变化分析的来源,因为半子叶承载胚胎将有更多的植物防御素,更RNA含量。
除了由成熟群体和除去种皮和胚芽在这些实验的分析,它指出几个观察是很重要的:1)虽然结果示长达96小时培养时,建议使用不超过72小时,得到一致的结果,因为种子得到了96小时降解;和b),而从同一种子半子叶,虽然随机取样,不构成完全独立样本,RT-PCR和转基因事件中的黄曲霉毒素的积累表明种子间的最小变化。此外,精确的真菌孢子数,接种量第2微升,与应用避免滴落在两侧的子叶的切割表面孢子是重要的,以确保该发芽的孢子暴露于植物组织。在板上的水/琼脂应为1.5%(重量/体积),较软琼脂使孢子径流,如图4(底)的最后一帧上。 ;应该从一个特定的转基因事件的种子的可用性是有限的,采样可在重复的,而不是一式三份得到类似的结果(即,图7)来完成然而,一式三份样本将有助于降低标准误差。该方法的唯一限制是它要求一个高度敏感的系统(UPLC)黄曲霉毒素检测/定量,但在同一时间这降低高估的RNAi的效果的不应该被较不敏感的方法来检测的黄曲霉毒素的概率。
总之,本方法提供了在第一时间来研究的可靠方法RNA干扰中黄曲霉毒素的控制效果。减少的时间,从整个种植季节进行实验,以不到一周的时间,这种方法将极大地加快对缓解和/或消除黄曲霉毒素的RNA干扰花生/ 曲霉菌病害系统研究。
The authors have nothing to disclose.
This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.
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