Bu videonun amacı klinik ortamda nadir mutasyonları tespit etmek formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) referans standart hücre hatları ve dijital damlacık PCR (ddPCR) analizden otomatik DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. FFPE örneklerde mutasyonları tespit edilmesi FFPE örneklerinde ddPCR klinik faydasını ortaya koyar.
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
Kilit düzenleyici genlerde genetik mutasyon birikimi kanseri 1 giden, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve hayatta kalma gibi normal hücre programlamayı değiştirir. RAS-RAF-MAP kinaz yolu, büyüme sinyallerine hücresel tepkileri aracılık eder. Onkogenik BRAF mutasyonlar 2 aşırı aktif olma onkoprotein BRAF neden olabilir BRAF genindeki mutasyonlar sürücüsü, kaynaklanabilir. BRAF genindeki mutasyonlar da sırayla, büyüme faktörü aracılığında düzenlenmesinin 4-6 bağımsız aşırı hücre büyümesi ve çoğalmasına neden, MEK ve ERK 3 aracılığıyla aşırı akış aşağı sinyal ile sonuçlanır.
Bazı araçlar örneğin ddPCR tarafından formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) referans standardı hücre hatlarında kantitatif gerçek zamanlı BRAF V600E mutasyonlar gibi DNA mutasyonu profil mevcuttur. ddPCR mutlak ölçümü için bir PCR bazlı yöntemGeleneksel kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) 7,8 oranla daha yüksek doğruluk sunar. ddPCR aynı zamanda daha detaylı kanser araştırma ve tanı 9 sağlayan DNA şablonları nadir mutasyonların saptanması için güç ve doğruluk çözme daha içerir. Düşük şablon kopya sayıları 10-12 okuyan zaman geleneksel qPCR üzerinde ddPCR ek avantajları geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk içerir. Burada, otomatik ddPCR tarafından BRAF V600E mutasyonların varlığını veya yokluğunu tespit ederek, ardından FFPE referans standardı hücre çizgileri, DNA ekstre için bir protokol olduğunu göstermiştir. Veri analizi ve sonuçlarının grafik bir gösterimi için yazılım kullanımı da tarif edilmektedir. Tüm işlem nispeten basittir ve tamamen profilli numune sayısı ve mevcut klasik bir PCR ve ddPCR makineleri sayısına bağlıdır.
Aşağıdaki protokol BR standart prosedürleri açıklar AF V600E pozitif FFPE referans standardı hücre çizgileri (HD598, HD593, HD617, HD273 ve yabani tipteki (WT)) Doku Hazırlanması System (TPS) protokolü kullanılarak tam otomatik bir cihaz içinde gerçekleştirilir. Ardından, izole edilmiş DNA örnekleri ddPCR sistemi kullanılarak BRAF V600E mutasyonların varlığı için analiz edilir. Tüm örnekler profilli edildikten sonra hedeflenen mutasyon analizi yapılır ve veri veri analiz yazılımı içine yüklendi. Örneklerin sayısına bağlı olarak / grup çalışıldı, veri analizi bir ile birkaç saat gerekebilir. Metodolojinin deneysel bileşeni alınmasında doğruluk gerektirir DNA vesayısal hava Pipetler ve Pipet, pipetleme bağlamında ilgili daha fazla açıklayan bir jove Öğrenim Video "> 96 gözlü plakalara pipetleme veri analiz yazılımı kullanılarak yapılır ise.
Burada, belirli bir gen mutasyonu değerlendirmesi için FFPE referans standardı hücre çizgisi örneklerinden ddPCR uygulanabilirliğini ve DNA izolasyonu vurgulayın. Bu çalışmada, TPS otomatik DNA izolasyon yöntemi kolayca, otomatik adapte edilebilir kullanılır ve büyük ölçekli deneyler ve alt değişkenliği sağlayan, aynı anda 48 farklı örnekleri kapasitelidir. Mevcut çalışmada DNA izolasyonu sınırlamaları biri her FFPE örnek tektir ve yüzey kirleticiler, mikrobiyal flora birbirlerini deği?…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma Science, ICT ve Gelecek Planlaması (Hibe No 2013M3C8A1075908) Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı Derneği için Ar-Ge Programı (UÇK) tarafından desteklenmiştir.
Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
DNA isolation kit | |||
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
CO-RE tips | Siemens | ||
ddPCR mutation analysis | |||
ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |