Employant numérique Droplet PCR pour détecter des mutations BRAF V600E dans de paraffine standard de référence lignées cellulaires fixés au formol
Summary
Le but de cette vidéo est de montrer comment effectuer une extraction d'ADN automatisée à partir des lignes de formol paraffine (FFPE) référence standards cellulaires et gouttelettes numérique PCR (ddPCR) analyse pour détecter des mutations rares dans un cadre clinique. Détecter des mutations dans des échantillons FFPE démontre l'utilité clinique de ddPCR dans les échantillons FFPE.
Abstract
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
Introduction
L'accumulation de mutations génétiques dans les gènes régulateurs clés modifie la programmation de la cellule normale, comme la prolifération cellulaire, la différenciation et la survie, menant au cancer 1. La voie de RAS-RAF kinase-MAP médie la réponse cellulaire aux signaux de croissance. Mutations oncogènes BRAF peuvent résulter de mutations du pilote dans le gène BRAF, qui peuvent causer l'oncoprotéine BRAF pour devenir hyperactive 2. Des mutations dans le gène BRAF se traduisent également par la signalisation en aval par l'intermédiaire d'hyperactivité de MEK et ERK 3, qui, à son tour, conduit à une croissance cellulaire excessive et la prolifération indépendamment de la régulation de la croissance médiée par le facteur 6/4.
Plusieurs outils sont disponibles pour les mutations de l'ADN profilage, tels que quantitatives en temps réel des mutations BRAF V600E dans de formol, inclus en paraffine (FFPE) référence des lignes de cellules standard par ddPCR. ddPCR est une méthode basée sur la PCR pour la quantification absolue-offrant une plus grande précision par rapport à quantitative en temps réel classique de PCR (qPCR) 7,8. ddPCR fournit également une plus grande puissance et de la précision de la résolution de la détection des mutations rares dans des matrices d'ADN, permettant recherche sur le cancer et le diagnostic plus informative 9. Des avantages supplémentaires de ddPCR sur qPCR conventionnelle incluent sa sensibilité accrue et la précision lors de l'étude des nombres de copies bas de modèle 10-12. Ici, un protocole d'extraction automatique d'ADN à partir de lignées de cellules standards de référence FFPE, suivie par détermination de la présence ou de l'absence de mutations BRAF V600E par ddPCR est démontrée. L'utilisation du logiciel d'analyse de données et une représentation graphique des résultats sont également décrits. L'ensemble de la procédure est relativement simple et dépend du nombre d'échantillons à être profilées et le nombre de machines PCR et ddPCR classiques disponibles totalement.
Le protocole suivant décrit les procédures standard pour BR Des lignées de cellules positives AF-V600E FFPE référence standards (HD598, HD593, HD617, HD273 et de type sauvage (WT)) est réalisée dans un instrument entièrement automatisé en utilisant le système de préparation tissulaire (TPS) protocole. Par la suite, des échantillons d'ADN isolés sont analysés pour la présence de mutations BRAF V600E utilisant le système ddPCR. Analyse de mutation ciblée est réalisée après que tous les échantillons ont été profilée et les données ont été chargées dans le logiciel d'analyse des données. Selon le nombre d'échantillons / groupes étudiés, l'analyse des données peut exiger d'une à plusieurs heures. Le composant expérimentale de la méthode nécessite une précision dans la manipulation de l'ADN etrologique Pipettes et pipettes, une vidéo JoVE enseignement des sciences en expliquant plus sur sur le contexte de pipetage "> pipetage en plaques à 96 puits, tandis que l'analyse des données est effectuée en utilisant le logiciel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous mettons en évidence l'applicabilité de ddPCR et l'isolement de l'ADN à partir d'échantillons de lignées cellulaires standards de référence FFPE une évaluation spécifique de la mutation du gène. Dans cette étude, TPS méthode d'isolement d'ADN automatisé est utilisé qui peut être facilement adapté, automatisé, et peut accueillir jusqu'à 48 échantillons différents simultanément, permettant de plus grandes expériences à grande échelle et une plus faible variabili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le Programme de R & D pour la Société de la National Research Foundation (NRF), financé par le ministère de la Science, les TIC et la planification future (Grant No. 2013M3C8A1075908).
Materials
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
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