Gebruikmakend Digital Droplet PCR om BRAF V600E Mutaties Detect in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde Reference Standard cellijnen
Summary
Het doel van deze video wijzen voor geautomatiseerde DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) referentiestandaard cellijnen en digitale druppeltje PCR (ddPCR) analyse zeldzame mutaties te detecteren in een klinische setting voeren. Detecteren van mutaties in FFPE monsters toont de klinische bruikbaarheid van ddPCR in FFPE monsters.
Abstract
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
Introduction
De accumulatie van genetische mutaties in genen sleutelregulatoren wijzigt normale cel programmeertaal zoals celproliferatie, differentiatie en overleving, wat leidt tot kanker 1. De RAS-RAF-MAP kinase route bemiddelt cellulaire reactie op groeisignalen. Oncogene BRAF mutaties kunnen resulteren uit driver mutaties in het BRAF gen, dat de BRAF oncoprotein kan veroorzaken 2 overactief worden. Mutaties in het BRAF gen ook tot overactieve stroomafwaartse signalering via MEK en ERK 3, die op zijn beurt leidt tot excessieve celgroei en proliferatie onafhankelijk van groeifactor gemedieerde regulering 4-6.
Verschillende instrumenten zijn voor DNA-mutatie profileren, zoals kwantitatieve real-time BRAF V600E mutaties in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) referentiestandaard cellijnen door ddPCR. ddPCR is een PCR-methode voor absolute kwantificeringmet hogere nauwkeurigheid in vergelijking met conventionele kwantitatieve real-time PCR (qPCR) 7,8. ddPCR ook hoger oplossend vermogen en nauwkeurigheid van de detectie van zeldzame mutaties in DNA-matrijzen, waardoor informatiever kankeronderzoek en diagnostiek 9. Bijkomende voordelen van ddPCR opzichte van conventionele qPCR onder meer de verbeterde gevoeligheid en nauwkeurigheid bij het bestuderen van lage template kopie-aantallen 10-12. Hierin wordt een protocol voor het automatisch extraheren van DNA uit FFPE referentienorm cellijnen, gevolgd door bepaling van de aanwezigheid of afwezigheid van BRAF V600E mutaties door ddPCR aangetoond. Het gebruik van software voor data-analyse en grafische weergave van de resultaten zijn ook beschreven. De gehele procedure is relatief eenvoudig en volledig afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden geprofileerd en aantal conventionele PCR en ddPCR machines beschikbaar.
Het volgende protocol beschrijft standaardprocedures voor BR AF V600E-positieve FFPE referentiestandaard cellijnen (HD598, HD593, HD617, HD273 en wildtype (WT)) wordt uitgevoerd in een volledig geautomatiseerd instrument met de Tissue Preparation System (TPS) protocol. Vervolgens worden geïsoleerde DNA-monsters geanalyseerd op de aanwezigheid van BRAF V600E mutaties via ddPCR systeem. Gerichte mutatie analyse uitgevoerd nadat alle monsters zijn geprofileerd en de gegevens zijn in de data-analyse software geladen. Afhankelijk van het aantal samples / groepen bestudeerd, gegevensanalyse kan van één tot enkele uren. De experimentele component van de methode vereist nauwkeurigheid bij de behandeling van DNA enrological pipetten en Pipetten en een Jove Science Education video over het uitleggen over de context van pipetteren "> pipetteren in 96 well platen, terwijl de data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van software.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier belichten we de toepasbaarheid van ddPCR en DNA-isolatie uit FFPE referentie standaard cellijn monsters voor een bepaalde genmutatie assessment. In deze studie wordt TPS geautomatiseerde DNA-isolatie methode die gemakkelijk kan worden aangepast, geautomatiseerde, en is geschikt voor maximaal 48 verschillende monsters tegelijk, waardoor voor grotere schaal experimenten en lagere variabiliteit. Een van de beperkingen van de DNA-isolatie in dit werk is dat elke FFPE sample is uniek en verschilt elkaar verontreiniginge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de R & D-programma voor de Vereniging van de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT & Future Planning (Grant No. 2013M3C8A1075908).
Materials
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, ‘definetherain’. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
