Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.
Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.
פגיעה בחוט השדרה טראומטית (SCI) היא מצב קליני הרסני המשפיע על הפונקציות הסנסורית והאוטונומיות של SC. חולים ששרדו SCI לעתים קרובות נשארים עם מתיש paraplegia שמשפיע באופן משמעותי את הפעילות היומית שלהם ואיכות חייהם 1. מודלים הניסיוניים SCI היו כלי הכרחי בחקירה המדעית להבין את הפתופיזיולוגיה של SCI ותהליכי תיקון עצבי קשורים. מודלים אלה יש גם שימשו לבדיקת היעילות פרה-קלינית של התערבויות נוירו ניסיוניות שונות שמטרתם החלמה תפקודית. נכון לעכשיו, רוב דגמי SCI בפועל להעסיק את השימוש בכח פיזי בוטה לשבש מכאני ולפגוע בSC. שיטות אלה כוללות חבלה, דחיסה, נקע וחיתוך רוחב של SC 2. זה כבר הציע כי לאחר העלבון המכני העיקרי פגיעה משנית בצורה של סטי איסכמיה בSC הפצוע 3,4. אטיולוגיה של איסכמיה המשנית כוללת ניוון נרחב רקמות, דימום parenchymal ולפעמים על ידי חסימה של כלי דם על ידי בצקת רקמת 5-7. כתוצאה מהפגיעה המשנית שלמות SC מושפעת נוספת, תאי עצב ותאי גליה הם נפגעים קשים בתפקוד וביכולת קיום ועוברים אפופטוזיס שמוביל לאוטם צמיחה בשלב הכרוני של פציעה, מקביל לצמיחה של השבץ איסכמי הבא פנומברה 8,9. מספר מנגנונים כמו הפעלת יתר רעילה, ייצור של רדיקלים חופשיים, ודלקת כבר דיווחו להיות אחראי למותם של תאי איסכמי הבאים SCI 10,11. בנוסף, איסכמיה SC הוא סיבוך חמור של ניתוחי תיקון מפרצת אב העורקים thoraco-בטן אשר לעתים קרובות להוביל לparaplegia בחולי 12,13. למרות השפעה קלינית כה גבוהה מעט מאוד מודלים של איסכמיה חוט השדרה עם שחזור גבוה זמינים כרגע.
NT "> Photothrombosis (PT) הוא שיטה נפוץ לאינדוקציה של איסכמיה מוקדי במוח 14-20. הטכניקה היא די בלתי פולשני, שחזור מאוד ומייצר נגע איסכמי מוקד מדויק באזור החשוף של המוח 17 -21. זו מושגת על ידי ממשל מערכתי של צבעי photoactive כמו רוז בנגל (RB) 16-20,22 או erythrosine B 23 ואחריו הקרנה מקומית של כלי דם עם מקור אור נכון. Photoactivation של הצבע גורם לייצור של רדיקלים חופשיים ש לשבש את שלמותו של האנדותל כלי הדם החלק, ולגרום לטסיות הדם לצבור, אשר לאחר מכן יוצר קריש דם. החסימה של זרימת דם על ידי קריש הדם בתוצאות אוטם באזור המסופק על ידי כלי השיט 24. בשל להקל שליטה על עוצמת ומשך הקרנת הליך זה מניב אוטם אחיד ושחזור מאוד. יתר על כן, בשיטה זו יכולה להיות מועסק על מנת לגרום לinfarcלא במקומות אנטומיים שונים מאפשר הבנה מרחבית (למשל, חומר אפור לעומת חומר לבן) של ההשפעה של איסכמיה.מטרת המחקר הנוכחי היא לפתח מודל קל מאוד לשחזור של איסכמיה SC בעכברים. אנחנו תיארנו את ההליך של מודל PT של איסכמיה SC בעכברים. תוצאות מהיסטולוגיה וimmunostaining הוכיחו כי PT יכול למעשה לגרום לאוטם SC, אובדן עצבי ודבק תגובתי.
במחקר זה, שתארנו מודל photothrombotic של איסכמיה SC. בשל התקדמות בהנדסה גנטית חל זינוק בעכברים מהונדסים זמינים מסחרי שהפך אותו ניתן ללמוד את ההשפעה של גנים ספציפיים המעורבים בפתופיזיולוגיה איסכמי בSC. מטרת המחקר הייתה לפתח מודל עכבר לשחזור של איסכמיה חוט השדרה. כאן א…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות [גרנט לא. R01NS069726] ואגודת הלב האמריקאי גרנט בסיוע גרנט [גרנט לא. 13GRNT17020004] לSD.
Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
C57Bl6/J | Jackson lab | 664 | 22-25g |
Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4×4 in plate to adjust the height of the animal |
X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |