Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.
Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.
Traumatisme de la moelle épinière (SCI) est un état clinique dévastatrice qui affecte les fonctions sensori-motrices et autonomes de la SC. SCI patients survivants se retrouvent souvent avec une paraplégie débilitante qui affecte considérablement leurs activités et de la qualité de la vie quotidienne 1. SCI modèles expérimentaux ont été un outil indispensable dans la recherche scientifique pour comprendre la physiopathologie de la SCI et les processus de réparation de neurones associés. Ces modèles ont également été utilisés pour tester l'efficacité préclinique de diverses interventions neuroprotectrices expérimentales qui visent à la récupération fonctionnelle. Actuellement, la majorité des modèles SCI dans la pratique emploient l'utilisation de la force physique brutale de perturber mécaniquement et blesser le SC. Ces méthodes comprennent contusion, compression, la dislocation et transection du SC 2. Il a été suggéré que, après l'insulte mécanique primaire une lésion secondaire sous la forme d'ensembles d'ischémie dans la SC blessé 3,4. L'étiologie de l'ischémie secondaire comprend une vaste dégénérescence des tissus, l'hémorragie parenchymateuse et parfois par l'obstruction des vaisseaux sanguins par un œdème des tissus 5-7. À la suite de la lésion secondaire l'intégrité de SC est en outre affectée, les neurones et les cellules gliales sont gravement altérées dans la fonction et la viabilité et l'apoptose qui conduit à l'infarctus croissance au cours de la phase chronique de la blessure, analogue à la croissance de pénombre ischémique suite d'un AVC 8,9. Plusieurs mécanismes comme excitotoxicité, production de radicaux libres, et l'inflammation ont été signalés à être responsable de la mort cellulaire ischémique suivant SCI 10,11. En outre, SC ischémie est une complication grave de l'anévrisme aortique thoraco-abdominaux chirurgies de réparation qui conduisent souvent à la paraplégie chez les patients 12,13. En dépit de cet impact clinique haute très peu de modèles de ischémie de la moelle épinière avec une reproductibilité élevée sont actuellement disponibles.
nt "> Photothrombosis (PT) est une méthode couramment utilisée pour l'induction d'une ischémie focale dans le cerveau 14-20. La technique est assez non-invasif, hautement reproductible et produit une lésion ischémique focal précis dans la zone exposée du cerveau 17 -21. Ceci est réalisé par administration systémique de colorants photoactifs tels que le rose Bengale (RB) 16-20,22 érythrosine B ou 23 suivie par une irradiation localisée de vaisseaux sanguins avec une source de lumière appropriée. photoactivation du colorant provoque la génération de radicaux libres qui perturber l'intégrité de l'endothélium vasculaire lisse, et provoquent les plaquettes d'accumuler, qui forme ensuite un thrombus. L'obstruction de la circulation sanguine par les résultats de thrombus dans un infarctus dans la région fournies par le navire 24. En raison de la facilité de contrôle de la l'intensité et la durée de l'irradiation de cette procédure donne un infarctus très uniforme et reproductible. En outre, ce procédé peut être utilisé pour induire un infarctust à divers emplacements anatomiques permettant spatiale (par exemple, la matière grise vs. matière blanche) compréhension de l'effet de l'ischémie.L'objectif de la présente étude est de développer un modèle facile et hautement reproductible de SC ischémie chez les souris. Nous avons décrit la procédure d'un modèle d'ischémie PT de SC chez des souris. Les résultats de l'histologie et immunomarquage ont démontré que PT peut induire efficacement SC du myocarde, une perte neuronale et une gliose réactive.
Dans cette étude, nous avons décrit un modèle de photothrombotique SC ischémie. Grâce aux progrès en génie génétique, il ya eu une forte augmentation des souris transgéniques disponible dans le commerce qui a permis d'étudier l'impact des gènes spécifiques impliqués dans la physiopathologie ischémique dans la SC. Le but de l'étude était de développer un modèle de souris reproductible de ischémie de la moelle épinière. Ici nous avons adapté un modèle PT corticale pour …
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health [Grant pas. R01NS069726] et l'Association Grant American Heart in Aid Grant [Grant pas. 13GRNT17020004] pour SD.
Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
C57Bl6/J | Jackson lab | 664 | 22-25g |
Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4×4 in plate to adjust the height of the animal |
X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |