Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.
Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.
Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) is een verwoestende klinische aandoening van de sensomotorische en autonome functies van de SC. Patiënten overleven SCI worden vaak achter met slopende dwarslaesie die een aanzienlijke invloed op hun dagelijkse activiteiten en de kwaliteit van het leven 1. Experimentele SCI modellen zijn een onmisbaar instrument in het wetenschappelijk onderzoek naar de pathofysiologie van SCI en bijbehorende neurale herstelprocessen begrijpen geweest. Deze modellen zijn ook gebruikt om de preklinische effectiviteit van verschillende experimentele neuroprotectieve interventies die zijn gericht op functioneel herstel testen. Momenteel is de meerderheid van de SCI-modellen in de praktijk in dienst van het gebruik van fysieke stomp mechanisch verstoren en verwonden van de SC. Deze werkwijzen omvatten kneuzing, compressie, dislocatie en doorsnijding van de SC 2. Gesuggereerd is dat na de primaire mechanische insult secundaire beschadiging in de vorm van ischemie sets in de gewonde SC 3,4. De etiologie van secundaire ischemie bevat uitgebreide weefsel degeneratie, parenchymale bloedingen en soms door verstopping van bloedvaten door weefseloedeem 5-7. Door de secundaire schade de integriteit van SC wordt verder beïnvloed worden neuronen en gliacellen ernstig verminderde functie en levensvatbaarheid en apoptose ondergaan die leidt tot groei infarct in de chronische fase van letsel, analoog aan de groei van ischemische penumbra na beroerte 8,9. Verschillende mechanismen als excitotoxiciteit, vrije radicalen en ontstekingen zijn gerapporteerd verantwoordelijk voor ischemische celdood na SCI 10,11 te zijn. Bovendien, SC ischemie is een ernstige complicatie van thoraco-abdominale aorta aneurysma chirurgie die vaak leiden tot paraplegie bij de patiënten 12,13. Ondanks deze grote klinische effect weinig modellen van ruggemerg ischemie hoge reproduceerbaarheid beschikbaar.
nt "> Photothrombosis (PT) is een algemeen gebruikte werkwijze voor de inductie van focale ischemie in de hersenen 14-20. De techniek is tamelijk non-invasieve, uiterst reproduceerbaar en levert een nauwkeurige focale ischemische laesie op het blootgestelde oppervlak van de hersenen 17 -21. Dit wordt bereikt door de systemische toediening van de fotoactieve kleurstoffen zoals Rose Bengal (RB) 16-20,22 of erythrosine B 23 gevolgd door lokale bestraling van bloedvaten met de juiste lichtbron. Fotoactivatie van de kleurstof zorgt ervoor dat de vorming van vrije radicalen die verstoort de integriteit van de gladde vasculaire endotheel, waardoor de bloedplaatjes te verzamelen, die vervolgens vormt een thrombus. De obstructie van de bloedstroom door de thrombus resulteert in een infarct in de door het vat 24 toegevoerd regio. wegens gemak van controle van de intensiteit en duur van de bestraling procedure levert een zeer gelijkmatige en reproduceerbare infarct. Bovendien kan deze methode worden toegepast om een infarc inducerent op verschillende anatomische locaties waardoor ruimtelijke (bv grijze stof versus witte stof) inzicht in het effect van ischemie.Het doel van dit onderzoek is het eenvoudig en zeer reproduceerbaar model van SC ischemie in muizen ontwikkelen. We beschreven procedure van een PT model SC ischemie in muizen. Resultaten van histologie en immunokleuring aangetoond dat PT effectief induceren SC infarct, neuronaal verlies en reactieve gliosis.
In deze studie, beschreven we een fototrombotisch model van SC ischemie. Door de vooruitgang in gentechnologie is er een uitgesproken in de handel verkrijgbare transgene muizen die het mogelijk heeft gemaakt om het effect van specifieke genen die betrokken zijn bij de pathofysiologie van ischemische SC kunnen bestuderen. Het doel van de studie was om een reproduceerbaar muismodel van ruggemerg ischemie ontwikkelen. Hier aangepast we een corticale PT model aan SCI induceren in muizen. Na de operati…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [Grant niet. R01NS069726] en de American Heart Association Grant in Aid Grant [Grant niet. 13GRNT17020004] naar SD.
Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
C57Bl6/J | Jackson lab | 664 | 22-25g |
Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4×4 in plate to adjust the height of the animal |
X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |