신생아 설치류에서 분리 뇌간 - 척수 준비에 전기 생리학은 신경 호흡 네트워크 출력 녹화를 할 수 있습니다
Summary
The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.
Abstract
While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.
Introduction
호흡 옥시젠 (O 2) 흡수 및 이산화탄소 (CO 2)를 제거 가능하게 뇌에 의해 제어 복잡하고 생명 활동이다. 중앙 호흡기 드라이브는 모두 포유류 1 뇌간에있는 복잡한 네트워크, 양서류 2, 파충류 3, 조류 4 물고기 (5)에 의해 생성된다. 호흡의 연구는 생체 내에서 처리 할 수없는 경우에도, 정확한 역학적 조사 호흡 제어 네트워크에 직접 액세스를 필요로한다. 이를 위해, 아드리안과 Buytendijk는 뇌간 표면 레코드 아가미 환기 5와 연관된 리듬을 생성하는 전극을 배치 감소 금붕어 제제를 개발 하였다. 이 방법은이어서 신생아 설치류에서 사용하기 위해 1984 년 6 Suzue 의해 채택되었다. 이 제제의 출현은 호흡 신경 생물학에서 중요한 발전을 주도하고있다. 그것은 상대적으로 간단하기 때문에,이 기술은 H를 제시감수 리듬 모터 행동과 신생아 설치류 기원의 기본 조사의 넓은 범위에 의무입니다.
이 방법의 전체 목표는 흡기 신경 활동의 상관 관계를 기록하는 것, 호흡기 같은 호흡 리듬 네트워크에 의해 생성 된 가상의 호흡을했다. 이 방법은 모두 야생형 7 및 8 트랜스 제닉 동물의 호흡 변화 또는 약리학에 흡기 응답들을 타겟팅, 연구 목적의 넓은 범위에서 사용할 수있다. 기록 된 신호의 생리 학적 관련성에 관한 실험 구 심성 감각없이 낮은 온도에서 수행되며, ACSF 내 글루코스와 O 2의 농도가 높은 조건 하에서, 문제가 발생되었음을 주어진다. 생체 내 및 시험 관내 조건 사이의 명확한 차이가 있지만 (예., 흡기 버스트의 주파수는) 사실이 존재한다는 남아호흡 네트워크 (6)의 핵심 요소는 가능한 중요 기능 항상성 9,10- 연결된 강력한 리듬을 연구 할 수 있도록.
이러한 기술 개발의 사용 배후의 이론적 근거는 신생아에서 특히, 생체 내에서 거의 액세스 네트워크의 호흡 뇌간 요소에 직접 액세스를 용이하게하는 것이다. 뇌간은 엄격하게 통제 된 조건 아래에 배치되어 기록 된 리듬이 폐 또는 경동맥의 몸에서 말초 구 심성 입력에 의해 변조되지 않은, 연구 중심 호흡 드라이브 자체 11 일에 집중할 수 있습니다. 따라서, 이러한 액세스는 자극을 적용하고 출력 신호를 기록하기 위해 이용된다. 녹음 혈량 측정법 달리 호흡 리듬 체내 모든 구성 요소에 의해 변조된다 (예., 폐 팽만, 주변 화학 센서)를 어렵게 정확한 자극을 적용 할 수있다.
에서ewborn 쥐, 프로토콜은 인공 뇌 – 척수 (ACSF) 유지 고립 뇌간에 네 번째 복부 루트 신호와 절단 된 척수를 기록으로 구성되어 있습니다. 뇌간 – 척수 제제에 의해 생성 된 리듬 흡기 신호 (9)에 연결되어 각각의 느린 버스트들로 구성된다. 7 – 고립 된 뇌간 – 척수 준비 쉽게 4 (P4 P0)에 산후 일 0에서 쥐에서 촬영 가능한된다. 이 방법은 일반적으로 네트워크의 호흡 저산소 반응하고, 또한 탄산 혈증, 산증 또는 약물에 대한 반응을 평가하는 데 사용된다. 급성 저산소증 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 이 자극은 ACSF의 O 2의 인출에 의해 얻어진다; 이 방법은 일반적으로 저산소증 욕설 공차 및 응답 성을 평가하는 데 사용된다. 프로토콜은 저산소증 노출 단부 (도 1)까지 12 분부터 제 리듬 우울증을 유도한다. 이 우울증은 반전후 저산소 복구 12시. 실험 설계에 관하여, 그것은 뇌간의 주동이의 부분에있는 뇌교는, 리듬 발생기 (8)에 억제 작용을 가지고주의하는 것이 중요하다. 따라서, 전체 뇌간과 주동이의 척수의 준비는 낮은 리듬을 표시합니다. 기록 용 절연 샘플 뇌교의 포함은 실험 (13)의 목표에 따라 결정된다; 연수 나 네트워크에 뇌교 영향의 연구 결과 (14)를 비교하는 뇌교와없이 녹음을 필요로한다. 또한,이 기술의 이점 중 하나는, 중뇌 및 / 또는 diencephalic 영역 (15, 16)를 포함하는 제제의 입쪽 부분을 연장하는 것이 가능 본토 수질 호흡 네트워크에 이들 영역의 효과를 평가하기 위해 제조하는 가능성이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
호흡 활동의 정확한 정량화가 어려울 수 있습니다. 실제로, 호흡 자동 자발적 모두 일 수 함수이며, 즉, 환경, 인체의 요구, 감정 상태와 행동에 따라 변조된다. 이 기술의 장점은 호흡기 명령을 생성 할 책임 신경 요소의 분리이다. 따라서, 뇌간, 척수 – 제제와 혈량 측정법의 전기 생리 학적 기록은 각각 시험 관내 및 생체 내에서 신경 세포 호흡 전체 네트워크를 연구하는 상보적인 기술이?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children’s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.
Materials
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
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