Elettrofisiologia su isolati tronco cerebrale, midollo spinale Ammassi di Newborn Roditore Consente Neural Network respiratoria registrazione Uscita
Summary
The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.
Abstract
While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.
Introduction
La respirazione è un complesso e vitale attività controllata dal cervello, permettendo diossigeno (O 2) e l'assorbimento di anidride carbonica (CO 2) eliminazione. Il drive respiratorio centrale è generato da una complessa rete situata nel tronco cerebrale in entrambi i mammiferi 1, 2 anfibi, rettili, uccelli 3 4 5 e pesci. Anche se lo studio di respirazione può essere elaborata in vivo, precise indagini meccanicistiche richiedono l'accesso diretto alla rete di controllo respiratorio. A tal fine, Adrian e Buytendijk sviluppato una ridotta preparazione pesci rossi, in cui elettrodi posti sulla superficie del tronco cerebrale record ritmo generato associato ventilazione gill 5. Questo approccio è stato in seguito adattato da Suzue nel 1984 6 per l'impiego nei roditori appena nati. L'avvento di questa preparazione ha portato a significativi progressi nella neurobiologia respiratoria. Poiché è relativamente semplice, la tecnica presentato here è suscettibile di una vasta gamma di ricerche di base di comportamenti motori ritmici e le loro origini nei roditori appena nati.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di registrare il correlato neurale di attività inspiratoria, un ritmo respiratorio simile chiamato respirazione fittizia, prodotta dalla rete respiratoria. Questo metodo può essere impiegato in una vasta gamma di obiettivi di ricerca, puntando risposte inspiratori alle variazioni respiratorie o farmacologia in entrambi i selvatici tipo 7 e 8 animali transgenici. Dato che gli esperimenti vengono eseguiti a bassa temperatura, senza afferenti sensoriali, e in condizioni in cui le concentrazioni di glucosio e O 2 ai aCSF sono alti, questioni sono state sollevate per quanto riguarda la rilevanza fisiologica del segnale registrato. Mentre vi sono chiare differenze tra in vivo e in vitro condizioni (ad es., La frequenza di raffiche inspiratori) resta il fatto che la presenza digli elementi fondamentali della rete respiratoria 6 permettono di studiare un ritmo robusto associato ad una funzione omeostatica vitale 9,10.
La logica dietro lo sviluppo e l'utilizzo di questa tecnica è quello di facilitare l'accesso diretto agli elementi del tronco della rete respiratoria, che sono difficilmente accessibili in vivo, soprattutto nei neonati. Il tronco encefalico è posto in condizioni rigorosamente controllate: il ritmo registrato non è modulato da input afferenti periferici dai polmoni o gli organismi carotidei, permettendo lo studio di concentrarsi sul drive respiratorio centrale stessa 11. Così, questo accesso è utilizzato per applicare stimoli e registrare il segnale di uscita. In contrasto con pletismografia registrazioni, il ritmo respiratorio è modulata da tutti i suoi componenti in tutto il corpo (ad es., Distensione polmonare, chemosensori periferiche), rendendo difficile applicare stimoli precisi.
In unratto ewborn, il protocollo consiste nel registrare il quarto segnale ventrale root su un tronco isolato e midollo spinale troncato, mantenuto in fluido cerebrospinale artificiale (aCSF). Il ritmo generato dai preparativi del midollo spinale tronco-è composto da singole raffiche lenti che sono collegati al segnale inspiratorio 9. Isolato preparativi del midollo spinale tronco-sono facilmente registrabili in ratti da post-natale giorno 0-4 (P0 – P4) 7. Questo approccio è comunemente utilizzato per valutare la risposta ipossica della rete respiratoria, e anche la risposta ai ipercapnia, acidosi o droghe. Un protocollo acuta all'ipossia è presentato qui. Questa stimolazione è ottenuto dal prelievo di O 2 nel aCSF; questo approccio è comunemente utilizzato per valutare la tolleranza e la risposta agli insulti ipossici. Il protocollo induce una depressione ritmo dal primo minuto fino alla fine dell'esposizione ipossia (Figura 1) 12. Questa depressione è invertitadurante la post-ipossica 12 recupero. Per quanto riguarda il disegno sperimentale, è importante notare che il ponte, si trovano nella parte rostrale del tronco cerebrale, ha un'azione inibitoria sul generatore ritmo 8. Così, preparazioni di piena del tronco encefalico e del midollo spinale rostrale mostrano un ritmo inferiore. L'inclusione del ponte del campione isolata per la registrazione è determinato secondo il fine dell'esperimento 13; studio dell'influenza pontino sulla rete midollo allungato richiederebbe registrazioni con e senza il ponte di confrontare i risultati 14. Inoltre, uno dei vantaggi di questa tecnica è la possibilità di estendere la parte rostrale della preparazione per includere mesencefalico e / o regioni diencefaliche 15,16, che consenta di valutare l'effetto di queste regioni della rete respiratoria ponto-midollare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantificazione accurata dell'attività respiratoria può essere impegnativo. Infatti, la respirazione è una funzione che può essere sia automatica e volontaria, e che è modulata in base all'ambiente, le esigenze del corpo, lo stato emotivo ed il comportamento. Il vantaggio di questa tecnica è l'isolamento degli elementi neurali responsabili della produzione del comando respiratoria. Così, registrazioni elettrofisiologiche di preparati midollo spinale e tronco-pletismografia sono tecniche complementari …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children’s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.
Materials
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
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