新生児げっ歯類から単離された脳幹・脊髄調製物の電気生理学は、ニューラルネットワーク呼吸器の出力の記録を可能にします
Summary
The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.
Abstract
While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.
Introduction
呼吸は、二原子酸素（O 2）取り込みおよび二酸化炭素（CO 2）の除去を可能にする、脳によって制御される、複雑で重要な活動です。中央呼吸ドライブは、両方の哺乳類1、両生類2、爬虫類3、鳥4と魚5に脳幹に位置する複雑なネットワークによって生成されます。呼吸の研究は、生体内で処理することができたとしても、正確なメカニズムの調査は、呼吸制御ネットワークへの直接アクセスを必要とします。この目的を達成するために、エイドリアンとBuytendijkは脳幹表面記録に鰓換気5に関連して生成されたリズムを配置された電極れる減少金魚の準備を開発しました。このアプローチは、その後、新生児げっ歯類で使用するために1984年6で鈴江によって適応されました。この準備の出現は、呼吸器、神経生物学における重要な進歩をもたらしました。それは比較的単純であるので、この技術は時間提示しましたEREは、リズミカルな運動行動や新生児げっ歯類におけるその起源の基本的な調査の幅広い影響を受けやすいです。
この方法の全体的な目標は、吸気活動の神経相関、呼吸器ネットワークによって生成される仮想の呼吸と呼ばれる呼吸のようなリズムを記録することです。この方法は、野生型7と8トランスジェニック動物の両方における呼吸変動または薬理学的に吸気応答を標的、研究目的の広い範囲で使用することができます。記録された信号の生理学的な関連性についての実験は、感覚求心性なしに、低温で行われ、およびaCSFの中でグルコースとO 2の濃度が高い条件下では、問題が提起されていることを考えます。 in vivoおよびin vitro条件の間に明確な違いがありますが（ 例えば 、吸気バーストの周波数）は実際には存在することを残っています呼吸ネットワーク6のコア要素は、それが可能な重要な恒常性維持機能9,10に関連した強固なリズムを研究することを可能にします。
開発し、この技術の使用の理論的根拠は特に新生児で、 生体内でほとんどアクセス可能な呼吸器ネットワークの脳幹要素への直接アクセスを容易にすることです。脳幹は、厳密に制御された条件の下に置かれている：記録リズムが肺や頸動脈体からの末梢の求心性入力によって変調されていない、研究では、中央呼吸ドライブ自体11に集中することができます。したがって、このアクセスは、刺激を適用し、出力信号を記録するために利用されます。録音をプレチスモグラフィとは対照的に、呼吸リズムは、それが困難な正確な刺激を適用すること、身体（ 例えば 、肺の膨満、周辺化学センサー）を通じてそのすべてのコンポーネントによって変調されます。
におけるewbornラット、プロトコルは、人工脳脊髄液（aCSFの）中で維持孤立脳幹および短縮型脊髄の4番目の前根信号を、記録で構成されています。脳幹・脊髄調製物によって生成されたリズムが吸気信号 9に連結されている個々の遅いバーストで構成されています。 7 -絶縁脳幹・脊髄調製物は、簡単に4（P4 P0）に出 生後0日目からラットで記録すること。このアプローチは、一般に呼吸器ネットワークの低酸素応答、また高炭酸ガス血症、アシドーシスまたは薬物に対する応答を評価するために使用されます。急性低酸素症のプロトコルがここに提示されます。この刺激は、aCSFの中のO 2の撤退によって得られます。このアプローチは、一般的に低酸素傷害に対する耐性と反応性を評価するために使用されます。プロトコルは、低酸素曝露（ 図1）12 の端まで最初の分からリズムうつ病を誘発します。この凹部が逆になります低酸素後の回復12の間。実験計画については、それは脳幹の吻側部に位置橋は、リズム発生器8に対する阻害作用を有することに注意することが重要です。このように、完全な脳幹と吻側脊髄の調製物は、下のリズムを表示します。記録のために単離されたサンプル中の橋を含めると、実験13の目標に応じて決定されます。延髄ネットワーク上の橋影響の研究結果14を比較するために橋ととせずに録音を必要とするであろう。また、この手法の利点の一つは、脳および/ または間脳領域15,16を含むように製剤の吻側部分を拡張することが可能先斗、延髄呼吸ネットワーク上のこれらの領域の効果を評価することの可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
呼吸活性の正確な定量化が困難な場合があります。実際、呼吸は自動および自主両方にすることができます関数であり、それは環境、身体のニーズ、感情的な状態や行動に応じて変調されます。この技術の利点は、呼吸のコマンドを生成する原因神経要素の単離であります。したがって、脳幹・脊髄調製物とプレチスモグラフィの電気生理学的記録は、それぞれ、in vitroおよびin vivoで?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children’s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.
Materials
| Sylgard | Sigma Aldrich | 761036-5EA | Use under hood |
| NaCl | Bioshop | SOD002 | |
| KCl | Bioshop | POC888 | |
| CaCl2 | Bioshop | CCL444 | |
| MgCl2 | Bioshop | MAG510 | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | |
| NaH2PO4 | Bioshop | SPM306 | |
| D-glucose | Bioshop | GLU501 | |
| Carbogen | Linde | 343-02-0006 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Suction electrode | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 573000 | |
| Differential AC amplifier | A-M Systems, Everett, WA, USA | model 1700 | |
| Moving averager | CWE, Ardmore, PA, USA | model MA-821 | |
| Data acquisition system | Dataq Instruments, Akron, OH, USA | model DI-720 | |
| LabChart software | ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA | ||
| Prism sofware | Graphpad, La Jolla, CA, USA | ||
| Dissection chamber | Plastic box (e.g. petri box) will do | ||
| Recording chamber | Home made | ||
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Micromanipulator | World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA | KITE-R | |
| Base | Kanetec, Bensenville, IL, USA | MB | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | MINIPULS 3 | |
| Faraday Cage | Home made | ||
| Computer |
References
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