신 세뇨관 상피에서 발현 이온 채널은 다낭성 신장 질환의 병리에 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 갓 쥐의 신장에서 분리 낭포 성 상피 세포에서 패치 클램프 분석 및 세포 내 칼슘 수준 측정을 수행하는 데 사용되는 실험 프로토콜을 설명합니다.
다낭성 신장 질환 중 낭종 개시 및 확장은 관 모양의 세포 증식, 내강 유체 축적과 세포 외 기질 형성에 이상을 특징으로하는 복잡한 과정이다. 이온 채널 및 세포 내 칼슘 신호 전달의 활성은 관상 상피의 기능을 결정하는 중요한 생리적 파라미터이다. 우리는 갓 신장 낭종 분리 상피 단층 세포 내 칼슘 수준의 패치 – 클램프 기법 및 등록이 이온 채널 활성을 실시간으로 관찰하기에 적합한 방법을 개발 하였다. PCK 래트, 염색체 열성 다낭성 신장 질환 (ARPKD)의 유전 적 모델은, 이온 채널 및 칼슘 플럭스의 생체 외 분석을 위해 여기에 사용 하였다. 여기에 설명하는 하나의 채널 활동 및 세포 내 칼슘 역학을 낭성 단일 층 및 PCK 또는 일반 스프 라그 돌리 (SD) 쥐에서 비 넓혀 세관을 분리하고 모니터링하도록 설계 자세한 단계별 절차입니다.이 방법은 효소 처리를 필요로 갓 격리 상피 단층의 기본 설정에서 분석이 가능하지 않습니다. 또한,이 기술은 세포 내 칼슘의 변화에 매우 민감하고 정확한 측정을위한 고해상도 이미지를 생성한다. 마지막으로, 고립 된 낭성 상피 더 항체 또는 염료, 각종 생화학 적 분석을위한 차 문화의 준비 및 정제 염색에 사용할 수 있습니다.
이온 채널은 세포의 성장과 분화를 포함하여 많은 생리적 기능에 중요한 역할을한다. 상 염색체 우성과 열성 다낭성 신장 질환 (각각 ADPKD과 ARPKD는) 관 상피 세포 기원의 신 유체로 채워진 낭종의 개발에 의해 특징 유전 질환이다. ADPKD는 polycystins 1 세포 증식 및 분화의 조절에 관여 2, 막 단백질을 코딩 PKD1 또는 PKD2 유전자의 돌연변이에 의해 발생된다. 그 자체로 또는 PKD1과 복잡한 PKD2 또한 칼슘 -permeable 양이온 채널 1로 작동합니다. PKHD1 유전자 부호화 fibrocystin (세뇨관 및 / 또는 상피의 극성의 유지에 관여 섬모 수용체 – 관련 단백질과 같은)의 돌연변이는 ARPKD 2 유전 자극이다. 낭종의 성장은 복잡한 현상을 방해 확산 3,4, 혈관 신생 (5), 탈분화 및 극성의 손실을 동반한다관 모양의 세포 6-8의 성만.
담낭 상피 세포에 결함이 재 흡수와 분비 증강은 루멘과 낭종 확장 9,10 유체 축적에 기여한다. 손상된 흐름 의존성 [Ca를 2+] I 시그널링도 PKD 11-15 중 cystogenesis 연결되었다.
여기서, 우리는 하나의 채널 활동 및 PCK 래트로부터 단리 낭성 상피 세포 단층의 칼슘 농도의 패치 클램프 측정하기에 적합한 방법을 설명한다. 이 방법은 성공적으로 상피 나 + 채널 (ENAC) 10의 활동의 특성을 우리가 적용하고 [칼슘 2 +] 나는 칼슘 -permeable TRPV4 및 퓨린 신호 캐스케이드 (13)에 의해 유도되는 과정을 의존성.
이러한 연구에서 우리는 PCK 래트, PKHD1 유전자의 자연 돌연변이에 의한 ARPKD의 모델을 사용 하였다. PCK 변형은 originall의했다스프 라그 – 돌리 (SD) 래트 16함으로써 SD 래트 PCK 균주와 비교를위한 적절한 제어로 사용되는 Y로부터 유도. 그 결과, 동일한 PCK 래트로부터 단리 SD 래트 네프론 세그먼트 및 비 팽창 된 포집 관 모두 낭성 상피 실험 두 가지 비교 군으로 사용할 수.
우리는 ARPKD의 쥐의 유전자 모델에서 파생 된 담낭 상피 단층 여기에 기존의 패치 클램프 기술과 표면 형광 칼슘 이미징의 응용 프로그램을 설명했다. 프로토콜은 가장 관심 낭종 (프로토콜 부의 단계 1.5)의 단리 및 전기 생리 학적 연구에 지불되어야하는 세 단계로 구성된다. 이러한 주요 절차는 광범위한 훈련과 인내를 필요로하고, 독자는 한 번에 좌절해서는 안됩니다.
우?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 현미경 실험과 우수한 기술 지원을 글렌 슬로 컴 (위스콘신 의과 대학)과 콜린 A. Lavin (니콘 인스트루먼트 Inc의)에 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는 (AS에) R01 HL108880 (OPO에) R01 DK095029과 (TSP에) K99 HL116603 (TSP에) 국립 신장 재단 IG1724 (OPO에) 미국 심장 협회 (American Heart Association) 13GRNT16220002 및 부여 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 지원되었다 (DVI에) 신장의 미국 사회에서 벤 제이 Lipps 연구 활동.
Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
Flou-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |