Les canaux ioniques exprimés dans l'épithélium tubulaire rénal jouent un rôle important dans la pathologie de la maladie polykystique des reins. Nous décrivons ici les protocoles expérimentaux utilisés pour effectuer l'analyse et le niveau de calcium intracellulaire mesures patch-clamp dans l'épithélium kystique fraîchement isolées à partir de reins de rongeurs.
Cyst initiation et l'expansion au cours de la maladie polykystique des reins est un processus complexe caractérisé par des anomalies dans la prolifération des cellules tubulaire, l'accumulation de fluide luminal et formation de la matrice extracellulaire. L'activité des canaux ioniques et la signalisation intracellulaire de calcium sont des paramètres physiologiques clés qui déterminent les fonctions de l'épithélium tubulaire. Nous avons développé une méthode appropriée pour l'observation en temps réel de l'activité des canaux ioniques avec la technique de patch-clamp et l'enregistrement de Ca2 + intracellulaire niveau dans les monocouches épithéliales fraîchement isolés à partir de kystes rénaux. Rats PCK, un modèle génétique autosomique récessive de la maladie polykystique des reins (ARPKD), ont été utilisés ici pour l'analyse ex vivo de canaux ioniques et des flux de calcium. Décrit ici est une procédure étape par étape détaillé destiné à isoler monocouches kystiques et tubules non dilatée de PCK ou rats normaux Sprague Dawley (SD), et de surveiller l'activité de canal unique et dynamique intracellulaire de Ca2 +.Cette méthode ne nécessite pas de traitement enzymatique et permet une analyse dans un cadre natif de monocouche épithéliale fraîchement isolés. De plus, cette technique est très sensible aux variations de calcium intracellulaire et génère des images à haute résolution pour des mesures précises. Enfin, isolé épithélium kystique peut encore être utilisé pour la coloration avec des anticorps ou des colorants, la préparation des cultures primaires et la purification de différents dosages biochimiques.
Les canaux ioniques jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques, y compris la croissance et la différenciation cellulaires. Les maladies rénales autosomiques dominants et récessifs polykystiques (PKRAD et PKRAR, respectivement) sont des troubles génétiques caractérisées par le développement de kystes remplis de fluide rénal de l'origine des cellules épithéliales tubulaires. PKD est causée par des mutations de gènes codant pour PKD1 ou PKD2 polycystines 1 et 2, des protéines membranaires impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et la différenciation. PKD2 par lui-même ou sous forme de complexe avec PKD1 fonctionnent également en tant que cation -permeable canal 1 de Ca2 +. Les mutations du gène codant fibrocystine PKHD1 (une protéine de type récepteur cils associés impliqués dans le tubulogenèse et / ou maintien de la polarité de l'épithélium) sont l'impulsion génétique de ARPKD 2. La croissance de kyste est un phénomène complexe accompagnée de la prolifération perturbée 3,4, 5 l'angiogenèse, la dédifférenciation et la perte de polairelité de cellules tubulaires 6-8.
Réabsorption défectueuse et la sécrétion augmentée dans l'épithélium kystique contribuent à l'accumulation de liquide dans la lumière et l'expansion kyste 9,10. Facultés dépendant du débit [Ca2 +] i la signalisation a été également liée à kystogenèse cours PKD 11-15.
Ici, nous décrivons une méthode appropriée pour la mesure de patch-clamp de l'activité de canal unique et les niveaux intracellulaires de Ca2 + dans des monocouches epitheliales kystiques isolés de rats PCK. Cette méthode a été appliquée avec succès par nous pour caractériser l'activité du canal Na + épithélial (ENAC) et 10 [Ca2 +] i dépendante processus induits par le Ca 2+ TRPV4 -permeable et purinergique cascade de signalisation 13.
Dans ces études, nous avons utilisé des rats PCK, un modèle de ARPKD causée par une mutation spontanée dans le gène PKHD1. La souche PCK était originallY provenant de rats 16 rats ainsi SD sont utilisés comme un contrôle approprié pour la comparaison avec la souche PCK Sprague-Dawley (SD). En conséquence, les deux segments de rats SD néphron et des conduits non dilaté collecte isolés à partir de rats PCK mêmes peuvent servir de deux groupes de comparaison différents pour des expériences sur l'épithélium kystique.
Nous avons décrit ici applications de la technique de patch-clamp conventionnel et imagerie épifluorescence de calcium à des monocouches épithéliales kystiques dérivées d'un modèle génétique murine de ARPKD. Le protocole se compose de trois étapes, dont la plus grande attention devrait être accordée à l'isolement des kystes (étape 1.5 de la section des protocoles) et les études électrophysiologiques. Ces procédures clés nécessitent une formation approfondie et de patience, et le lecteur ne de…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) et Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) pour une excellente assistance technique avec des expériences de microscopie. Cette étude a été financée par les Instituts nationaux de la santé accorde R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (à OPO) et K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), l'American Heart Association 13GRNT16220002 (à OPO) et Ben Lipps J. bourse de recherche de l'American Society of Nephrology (DVI).
Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
Flou-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |