表现在肾小管上皮细胞离子通道在多囊肾病的病理一个显著的作用。这里,我们描述用于执行囊性上皮从啮齿动物肾脏新鲜分离的膜片钳分析和细胞内钙水平的测量的实验方案。
期间多囊肾囊肿萌生和扩展是一个复杂的过程,其特征在肾小管细胞增殖,管腔流体积累和细胞外基质的形成异常。离子通道和细胞内钙信号的活动是决定的肾小管上皮细胞功能的关键生理参数。我们开发适合于实时观察离子通道的活性与在上皮单层从肾囊肿新鲜分离的细胞内Ca 2+水平膜片钳技术和登记的方法。 PCK大鼠的常染色体隐性遗传性多囊肾病(ARPKD)遗传模型,这里被用作离子通道和钙流的体外分析。这里描述的是详细的一步一步的步骤旨在隔离囊性单层和非扩张管从PCK或正常只SD(SD)大鼠,并监视单通道活性和细胞内Ca 2+动力学。此方法不需要酶加工,并允许在分析新鲜分离的上皮单层的天然环境。此外,这种技术是将细胞内钙的变化非常敏感,并生成高分辨率的图像进行精确的测量。最后,分离的囊性上皮可进一步用于与抗体或染料,制备原代培养物的纯化和关于各种生化分析染色。
离子通道在许多生理功能,包括细胞生长和分化中发挥显著作用。常染色体显性和隐性多囊肾疾病(ADPKD和ARPKD,分别)是其特征在于,所述的肾小管上皮细胞起源的肾流体填充囊肿的发展遗传性疾病。多囊肾是由PKD1或PKD2编码polycystins 1和参与细胞增殖和分化的调节如图2所示,膜蛋白的突变引起的。 PKD2本身或作为与PKD1一个复杂也发挥作为钙 -permeable阳离子通道1。所述PKHD1基因编码fibrocystin(涉及小管和/或维持上皮极性的纤毛相关受体样蛋白)的突变是ARPKD 2的遗传动力。囊肿生长是一个复杂的现象,伴随着不安扩散3,4,5血管生成,分化和极性损失性肾小管细胞6-8。
有缺陷的再吸收和分泌增强囊性上皮有助于在管腔和囊肿膨胀9,10-流体积聚。受损的流量依赖性钙离子浓度我的信号也已PKD 11-15时挂cystogenesis。
这里,我们描述适用于单通道活性和细胞内Ca 2+水平的囊性上皮单层从PCK大鼠分离的膜片钳测量的方法。这种方法成功地被我们用于表征上皮细胞钠离子通道(ENaC的)10的活性和钙离子浓度依赖我引起的钙 -permeable TRPV4和嘌呤信号级联13处理 。
在这些研究中,我们使用的PCK大鼠,模型ARPKD引起的在PKHD1基因的自发突变。该PCK应变originallÿ从的Sprague-Dawley(SD)大鼠16从而SD大鼠被用作适当的控制用于 与PCK应变比较而得。其结果是,既大鼠肾段和非扩张集合管从同一PCK大鼠分离可以作为两个不同的比较组对囊性上皮实验。
我们在这里描述的传统膜片钳技术和表面荧光钙成像的应用程序从ARPKD的鼠的遗传模型导出囊性上皮单层。该协议包括三个步骤,其中最应引起重视的囊肿(协议节的步骤1.5)的隔离和电生理研究。这些关键步骤需要大量的训练和耐心,读者不应该立刻感到沮丧。
首先,最要注意的囊肿单层隔离的过程。制备的这一部分需要手工技巧和显著影响进一步的工作,作为检体和其连…
The authors have nothing to disclose.
作者想感谢格伦·斯洛克姆(威斯康星医学院)和科琳A.拉文(尼康仪器公司)与显微镜实验优秀的技术援助。这项研究是支持由美国国立卫生研究院授予R01 HL108880(以AS),R01 DK095029(以OPO)和K99 HL116603(以TSP),全国肾脏基金会IG1724(以TSP),美国心脏协会13GRNT16220002(以OPO)和本·J.里普斯研究奖学金由美国肾脏病学会(至DVI)。
Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
Flou-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
Shaker | Boekel Scientific | 260350 | |
Light source | Sutter Instrument Co | Lambda XL | with integrated shutter/filter wheel driver |
Neutral density filters | Nikon | ND4, ND8 | |
Objective | Nikon | SFluo | 40/1.3 DIC WD 0.22 oil |
Camera | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
Nikon microscope (inverted) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
Diamond pencil | Fisher Scientific | 22268912 | |
Image acquisition software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
Image analysis software | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Patch Clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
Low Pass Filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10 . 2 | |
Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
Binocular stereomicroscope | Nikon | SMZ745 | |
Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
Isofluorane anesthesia | http://www.vetequip.com/ | 911103 | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |