Orthotope implantatie en Perifere Immune Cell Monitoring in het II-45 Syngene Rat Mesothelioom Model
Summary
Het genereren van een orthotopic ratmodel van pleura maligne mesothelioom door implantatie van II-45 mesothelioom cellen in de pleurale holte van immuuncompetente ratten gepresenteerd. Een stroom cytometrische methode zeven immuuncelsubklassen in deze dieren analyseren vanuit een 25 gl bloedmonster wordt ook beschreven.
Abstract
De enorme toename van belangstelling immuun gebaseerde behandelingen voor kanker zoals vaccins en immune controlepunt remmers en beter begrip van de rol van de tumor micro-omgeving in behandelingsrespons collectief wijzen op de noodzaak van immuuncompetente orthotope modellen voor preklinische tests van deze nieuwe therapieën. Dit artikel laat zien hoe u een orthotope immuun-competente rat model van pleura maligne mesothelioom vast te stellen. Monitoring progressie van de ziekte in orthotopische modellen is beschaamd door de interne locatie van de tumoren. Om longitudinaal bewaken ziekteprogressie en zijn effect op circulerende immuuncellen in deze en andere rat modellen van kanker, een enkele buis flowcytometrie test die slechts 25 gl volbloed wordt beschreven. Dit verschaft kwantificatie van zeven immune parameters: totale lymfocyten, monocyten en neutrofielen, en T-cel subsets CD4 en CD8, B-cellen en natuurlijke killer cellen. Verschillende subsets van deze parameters zijn nuttig in verschillende omstandigheden en modellen, met de neutrofielen naar lymfocyt verhouding met de grootste hulpprogramma voor het monitoren van progressie van de ziekte in de mesothelioom model. Analyseren circulerende immuun cel niveaus met behulp van deze enkele buis methode kan ook helpen bij het toezicht op de respons op het immuunsysteem gebaseerde behandelingen en inzicht in de onderliggende mechanismen die leiden tot succes of falen van de behandeling.
Introduction
Maligne mesothelioom (MM) is een agressieve maligniteit die voortvloeit uit getransformeerde cellen in het membraan (mesothelium) die lijnen de longen en de buikholte, hart en inwendige geslachtsorganen, en is de meest voorkomende primaire tumor van de long holte of pleura 1,2 . Blootstelling aan asbestvezels is goed voor 80% van alle MM, en terwijl het verbod op het gebruik van asbest werden decennia geleden geïntroduceerd in de meeste westerse landen, is het wijdverbreide gebruik in de gemeenschap een dodelijke erfenis. De Wereld Gezondheids Organisatie schat dat 107.000 mensen wereldwijd sterven elk jaar van asbest gerelateerde ziekten, met sterftecijfers blijft toenemen. Een nieuwe niet-beroepsmatige incidentie wave is ook in opkomst en er is weinig begrip voor wanneer en op welk niveau dit hoogtepunt zal bereiken 3.
De meerderheid van de mensen met MM te laat gediagnosticeerd als systemische chemotherapie is een van de enige haalbare opties 4. De meest effective chemotherapie en de huidige 'standaard van zorg' (samen pemetrexed met cisplatine 5) werd meer dan 10 jaar geleden geïdentificeerd. Maar het falen van deze behandeling is onvermijdelijk en zijn er geen bewezen tweede regel opties, waardoor patiënten met een grimmige prognose en mediane overleving van slechts 12 maanden 2. Daarom is er een dringende onvervulde behoefte aan effectievere behandelingen. Ondanks het onderzoek van een aantal nieuwe therapieën in klinische studies geen resulteert in veranderingen in de praktijk. Dit is deels te wijten aan de lage (5%) overdracht van pre-klinische resultaten, doorgaans bij xenograft muismodellen om de klinische instelling 6-8. Dergelijke modellen niet getrouw herhalen complexe aspecten van de tumor micro-omgeving voorkomen in niet-fysiologische locaties, vaak met afwezigheid van een functionerend immuunsysteem 9.
Syngene orthotope modellen te maken een aanzienlijk realistischer tumor milieu dan de commonly gebruikt subcutane xenograft modellen als de tumoren zich in de juiste fysiologische locatie met een intact immuunsysteem 10,11. De grotere omvang van de rat verhoogt het gebruik als knaagdier ziektemodel, vooral in drug studies waarbij seriële bloedafnames moeten behandelingsrespons 12 en toxiciteit te beoordelen. Bovendien, in modellen waarin toezicht ziekteprogressie moeilijk vanwege de locatie van de tumoren (bijvoorbeeld in de pleurale holte), het vermogen tot ziekteprogressie controleren middels factoren die in het bloed is zeer aantrekkelijk. Het genereren van een syngene orthotope model borstvliesmesothelioma gebruik immuuncompetente ratten wordt beschreven. Bovendien wordt een eenvoudige en relatief niet-invasieve werkwijze voor het bewaken van pleurale ziekteprogressie door meting van circulerende immuuncellen ook beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit document Gegevens een werkwijze voor het genereren van een rat syngene orthotope model van pleuraal mesothelioom en een eenvoudige methode voor het bewaken van progressie van de ziekte door middel van longitudinale bloedafname.
De II-45 model werd ontwikkeld door het blootstellen Fischer 344 ratten asbestvezels 13. Hoewel deze blootstelling is de werkelijke dynamica van gastheer-asbest-immuunsysteem interacties mesothelioma pathogenese, heeft een lange vertragingstijd (rekenin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.
Materials
| EDTA Collection tube (0.5ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount™ Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1mL Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur™ 4 colour | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail?. Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What’s wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats!. Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
