مثلي زرع والأجهزة الطرفية المناعي رصد خلية في نموذج II-45 مسانج الجرذ ورم الظهارة المتوسطة
Summary
يتم تقديم جيل من نموذج الفئران مثلي ورم المتوسطة الخبيثة الجنبي بواسطة زرع II-45 خلايا ورم الظهارة المتوسطة في التجويف الجنبي من الفئران المختصة المناعي. وهناك طريقة تدفق cytometric لتحليل سبع مجموعات فرعية الخلايا المناعية في هذه الحيوانات من عينة الدم 25 ميكرولتر يوصف أيضا.
Abstract
تصاعد هائل من الاهتمام في العلاجات القائمة المناعي للسرطان مثل اللقاحات ومثبطات نقطة تفتيش المناعة، وزيادة فهم دور المكروية ورم في الاستجابة للعلاج، وتشير مجتمعة إلى الحاجة إلى نماذج مثلي في مأمن الحكومية المختصة لاختبار ما قبل السريرية من هذه العلاجات الجديدة. توضح هذه الورقة كيفية إنشاء نموذج الفئران المناعة المختصة مثلي ورم المتوسطة الخبيثة الجنبي. ومرتبك مراقبة تطور المرض في نماذج مثلي حسب الموقع الداخلي للأورام. لمراقبة طوليا تطور المرض وتأثيره على تعميم الخلايا المناعية في هذا المجال ونماذج الفئران أخرى من السرطان، أنبوب واحد قياس التدفق الخلوي مقايسة تتطلب سوى 25 ميكرولتر يوصف الدم الكامل. وهذا يوفر تقدير دقيق لسبعة المعلمات المناعي: مجموع الخلايا الليمفاوية، وحيدات والعدلات، فضلا عن مجموعات فرعية T خلايا CD4 و CD8، B-الخلايا والخلايا القاتلة الطبيعية. الغواصات مختلفةخدمات الاختبارات التربوية من هذه المعايير هي مفيدة في الظروف ونماذج مختلفة، مع العدلات إلى نسبة الخلايا اللمفاوية وجود أعظم فائدة لرصد تطور المرض في نموذج ورم الظهارة المتوسطة. تحليل تعميم مستويات الخلايا المناعية باستخدام هذه الطريقة أنبوب واحد يمكن أن تساعد أيضا في رصد استجابة للعلاجات تستند المناعة وفهم الآليات الأساسية التي أدت إلى نجاح أو فشل العلاج.
Introduction
ورم المتوسطة الخبيثة (MM) هو الورم الخبيث العدواني الذي ينشأ من الخلايا تحولت في الغشاء (ميسوثيليوم) أن خطوط الرئة وتجويف البطن والقلب والأعضاء التناسلية الداخلية، و هو الورم الرئيسي الأكثر شيوعا من تجويف الرئة أو غشاء الجنب 1،2 . التعرض لألياف الاسبستوس يمثل 80٪ من جميع MM، وبينما أدخلت حظر استخدام الأسبستوس منذ عقود في معظم البلدان الغربية، وقد ترك استخدام على نطاق واسع في المجتمع ارثا مميتا. وقد قدرت منظمة الصحة العالمية أن 107،000 شخص يموتون في العالم سنويا بسبب أمراض ذات صلة الأسبستوس، مع معدلات وفيات الاستمرار في زيادة. موجة حالات غير مهني جديدة تظهر أيضا، وهناك القليل من الفهم متى وعلى أي مستوى هذا سوف يصل إلى ذروته 3.
ويتم تشخيص معظم الناس مع MM في وقت متأخر عندما يمثل العلاج الكيميائي الجهازي أحد الخيارات الوحيدة القابلة للتطبيق 4. معظم effectiلقد تم تحديد العلاج الكيميائي و"معيار الرعاية" الحالي (بيميتريكسيد مع سيسبلاتين 5) قبل أكثر من 10 عاما. لكن فشل هذا العلاج أمر لا مفر منه وليس هناك أي خيارات سطر الثانية التي أثبتت جدواها، وترك المرضى الذين يعانون من التكهن قاتمة والبقاء على قيد الحياة وسيطة من أشهر 2 12 فقط. ولذلك، هناك حاجة غير الملباة ملحة لعلاجات أكثر فعالية. على الرغم من فحص عدد من العلاجات الجديدة في التجارب السريرية أيا منها لم يفض إلى تغييرات في الممارسة. ويرجع ذلك في جزء منه إلى انخفاض (5٪) نقل النتائج ما قبل السريرية، يؤديها بشكل عام في النماذج طعم أجنبي الماوس، لوضع السريرية 6-8. مثل هذه النماذج لا ألخص بأمانة الجوانب المعقدة للالمكروية الورم التي تحدث في أماكن غير الفسيولوجية، في كثير من الأحيان في غياب نظام المناعة يعمل 9.
نماذج مثلي مسانج خلق بيئة الورم بشكل ملحوظ أكثر واقعية من جتستخدم ommonly نماذج طعم أجنبي تحت الجلد كما تحدث الأورام في الموقع الفسيولوجية الصحيح مع سليمة الجهاز المناعي 10،11. حجم أكبر من الفئران يعزز استخدامه كنموذج المرض القوارض، وخاصة في الدراسات المخدرات حيث توجه الدم التسلسلي المطلوبة لتقييم الاستجابة للعلاج وسمية 12. وعلاوة على ذلك، في النماذج التي مراقبة تطور المرض صعب نظرا للموقع من الأورام (كما هو الحال في التجويف الجنبي)، والقدرة على مراقبة تطور المرض باستخدام العوامل الموجودة في التداول غير جذابة للغاية. يوصف توليد نموذج مثلي مسانج من ورم المتوسطة الجنبي استخدام الفئران في مأمن الحكومية المختصة. بالإضافة إلى ذلك، كما وصفت طريقة سهلة نسبيا وغير الغازية لرصد تطور المرض الجنبي عن طريق قياس تعميم الخلايا المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تفاصيل هذه الورقة طريقة لتوليد نموذج مثلي مسانج الفئران من ورم المتوسطة الجنبي وطريقة بسيطة لرصد تطور المرض من خلال اخذ عينات من الدم الطولية.
تم تطوير نموذج II-45 عن طريق تعريض فيشر 344 الفئران لألياف الاسبستوس 13. على الرغم من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.
Materials
| EDTA Collection tube (0.5ml) | Greiner Bio One GmbH | 450480 | |
| Rat T/B/NK Cell cocktail | BD Pharmingen | 558509 | anti-Rat CD3 APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78) |
| anti-RAT CD8a PE | Biolegend | 200608 | (IgG1vClone G28) |
| anti-Rat CD4 FITC (Domain 1) | Biolegend | 203406 | (IgG1 Clone OX-38) |
| anti-Rat CD45 PE/Cy7 | Biolegend | 202214 | (IgG1 Clone OX-1) |
| TruCount™ Tubes | Becton Dickinson | 340334 | Box of 50 absolute counting tubes |
| RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | |
| foetal bovine serum (FBS) | Scientifix | FBS500-S (lot# 010101-1) | |
| trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| PBS tablets | Medicago AB | 09-9400-100 | |
| 23Gx1¼ Needle | Becton Dickinson | 302008 | |
| 1mL Syringe | Becton Dickinson | 302 100 | |
| Fischer 344 Rat | Animal Resources Centre, Perth Australia | F344 | |
| I.S.O (Isoflurane USP) | Veterinary Companys Australia (VCA) | B7058 | |
| II-45 Rat Mesothelioma line | Zurich University | Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC | |
| FACSCalibur™ 4 colour | Becton Dickinson | 342975 | |
| TRIS-HCL | SIGMA | T3253 | |
| Ammonium Chloride | SIGMA | 9718 | |
| Anaesthetic Machine (The stinger) | Advanced Anaesthesia specialists | #00449 |
References
- Kao, S. C., et al. Malignant mesothelioma. Intern Med J. 40 (11), 742-7450 (2010).
- Zucali, P. A., et al. Advances in the biology of malignant pleural mesothelioma. Cancer Treat Rev. 37 (7), 543-558 (2011).
- Olsen, N. J., et al. Increasing incidence of malignant mesothelioma after exposure to asbestos during home maintenance and renovation. Med J Aust. 195 (5), 271-274 (2011).
- Zucali, P. A., et al. Thymidylate synthase and excision repair cross-complementing group-1 as predictors of responsiveness in mesothelioma patients treated with pemetrexed/carboplatin. Clin Cancer Res. 17 (8), 2581-2590 (2011).
- Vogelzang, N. J., et al. Phase III study of pemetrexed in combination with cisplatin versus cisplatin alone in patients with malignant pleural mesothelioma. J Clin Oncol. 21 (14), 2636-2644 (2003).
- Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Uncertainty in the translation of preclinical experiments to clinical trials. Why do most phase III clinical trials fail?. Curr Gene Ther. 9 (5), 368-374 (2009).
- Kamb, A. What’s wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
- Yakisich, J. S. An Algorithm for the Preclinical Screening of Anticancer Drugs Effective against Brain Tumors. ISRN Pharmacol. 2012, 513580 (2012).
- Basu, D., Herlyn, M. Defining microenvironments within mouse models that enhance tumor aggressiveness. Cancer Biol Ther. 8 (4), 380-381 (2009).
- Abolhassani, M., et al. Screening of well-established drugs targeting cancer metabolism: reproducibility of the efficacy of a highly effective drug combination in mice. Invest New Drugs. 4 (4), 1331-1342 (2011).
- Hudson, A. L., et al. Establishing a panel of chemo-resistant mesothelioma models for investigating chemo-resistance and identifying new treatments for mesothelioma. Sci Rep. 4, 6152 (2014).
- Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats!. Dis Model Mech. 2 (5-6), 206-210 (2009).
- Craighead, J. E., et al. Characteristics of tumors and tumor cells cultured from experimental asbestos-induced mesotheliomas in rats. Am J Pathol. 129 (3), 448-462 (1987).
- Hunter, S. D., et al. Lymphocyte subset analysis by Boolean algebra: a phenotypic approach using a cocktail of 5 antibodies and 3 color immunofluorescence. Cytometry. 15 (3), 258-266 (1994).
- Brando, B., et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42 (6), 327-346 (2000).
- Schnizlein-Bick, C. T., et al. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Gajkowska, A., et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells in leukapheresis product and bone marrow for clinical transplantation: a comparison of three methods. Folia Histochem Cytobiol. 44 (1), 53-60 (2006).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Kao, S. C., et al. High blood neutrophil-to-lymphocyte ratio is an indicator of poor prognosis in malignant mesothelioma patients undergoing systemic therapy. Clin Cancer Res. 16 (23), 5805-5813 (2010).
- Kao, S. C., et al. Validation of prognostic factors in malignant pleural mesothelioma: a retrospective analysis of data from patients seeking compensation from the New South Wales dust diseases board. Clin Lung Cancer. 14 (1), 70-77 (2013).
- Burt, B. M., et al. Circulating and tumor-infiltrating myeloid cells predict survival in human pleural mesothelioma. Cancer. 117 (22), 5234-5244 (2011).
- Weir, C., et al. Streptavidin: a novel immunostimulant for the selection and delivery of autologous and syngeneic tumor vaccines. Cancer Immunol Res. 2 (5), 469-479 (2014).
