Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц
Summary
We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.
Abstract
Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.
Introduction
Традиционные развития вакцины в основном использовали эмпирический подход опытной и ошибок. Тем не менее, с недавним развитием широкого спектра биоматериалов и открытий молекулярных детерминант иммунной активации, теперь можно рационально спроектировать вакцинных препаратов с биофизических и биохимических сигналов, полученных от патогенов 1,2. В частности, различные частицы платформы доставки лекарств были рассмотрены в качестве носителей вакцинных как они могут быть совместно с грузом субъединиц антигенов и иммуностимулирующих агентов, защищать компоненты вакцины от деградации и повышения их сотрудничество доставку антиген-представляющие клетки (АРС), проживающих в лимфе узлы (LNS), таким образом, максимально иммунную стимуляцию и активацию 3-5. В этом докладе мы описываем синтез "патогенных имитируя" системы наночастиц, называемые interbilayer сшитого многослойные везикулы (ICMVs), которые ранее были продемонстрированы как мощное platfor вакциным для надежных процессе индукции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и гуморального иммунного ответа в обоих системных и слизистых тканей отсеков 6-9. В частности, вакцинация ICMVs достигается существенно повысить уровень IgG в сыворотке против малярийного антигена, по сравнению с вакцинацией с обычными вспомогательными веществами (например, квасцы и Montanide) 7, а также вызвало мощные ответов CTL против опухолевых клеток и вирусных моделей призов у мышей 9. Здесь, используя ICMVs как система наночастиц модель вакцины, мы опишем методы для характеризации нано-вакцин составов, в том числе размера частиц и дзета-потенциал измерений и отслеживания оборота частицы в дренирующих лимфоузлов (dLNs) с использованием конфокальной микроскопии в тканях cryosectioned 7. Кроме того, мы представляем весь животного изображений на основе метода анализа расширение ответов CTL у мышей после усыновителя передачи люциферазы выражения антиген-специфических CD8 + Т-клеток 9,10. Наконец, мы деписец тетрамер окрашивания мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) для продольной количественного эндогенных ответов Т-клеток у мышей, вакцинированных с наночастицами 6,9.
ICMVs являются липидов на основе наночастиц препарат синтезированы путем регулируемого синтеза простых липосом в многослойных структурах, которые затем химически стабилизированных сшивающих головных групп фосфолипидов малеимид-функционализированного в липидных слоев с дитиольному сшивающих агентов 6. После ICMVs синтезируются, небольшая часть наночастиц может быть использовано для определения размера частиц и дзета-потенциал (т.е. поверхностный заряд частиц) с (DLS) системы динамического светорассеяния и дзета-потенциал анализатора. DLS измеряет изменения в рассеянии света в суспензии частиц, что позволяет определение коэффициента диффузии и гидродинамического размера частиц 11. Достижение последовательной размер частиц от партии к партии синтеза является критическимс размером частиц является одним из основных факторов, влияющих на лимфатический дренаж частиц вакцины в dLNs и последующего клеточного поглощения БТР 12,13. Кроме того, дзета-потенциал может быть получен путем измерения скорости частиц, когда электрический ток подводится, которая позволяет определять электрофоретической подвижности частиц и поверхности частиц заряда 11. Обеспечение последовательного дзета-потенциал значения частиц является важным, поскольку поверхностный заряд частиц определяет стабильность коллоидного, который имеет непосредственное влияние на дисперсию частиц во время хранения и после введения в естественных условиях 14,15. Для того, чтобы отслеживать локализацию частиц в dLNs, ICMVs могут быть помечены с заданными флуорофорами в том числе липофильных красителей и ковалентно-меченых антигенов. После иммунизации мышей может быть умерщвлены в различные моменты времени, dLNs резекции, cryosectioned и анализировали с конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет визуализировать лимфатической DraIНин обоих перевозчиков и антигена dLNs вакцин наночастиц. Разделы ткани могут быть дополнительно окрашены флуоресцентной меченых антител и используется для получения более подробной информации, такие как типы клеток, связанных с антигеном и формирования зародышевых центров, как мы показали, ранее 7.
После синтеза частиц оптимизирован и торговля в dLNs подтвердится, это очень важно для проверки выявление в в естественных условиях расширения CTL. Для того чтобы проанализировать извлечение антиген-специфических CD8 + Т-клеток в ответ на вакцинацию наночастиц, мы использовали модели антиген, овальбумин (OVA), с OVA 257-264 пептида (SIINFEKL) иммунодоминантном CD8 + Т-клеточного эпитопа, который позволяет детально иммунологические анализы антиген-специфических ответов Т-клеток для первоначального 16,17 разработки вакцины. В частности, допрашивать динамику расширения и миграции антиген-специфических CD8 + Т-клеток, мы сформировалидважды трансгенной мышиной модели, пересекая люциферазы светляков-выражения трансгенных мышей (Luc) с OT-I у трансгенных мышей, которые обладают CD8 + Т-клеток с Т-клеточного рецептора (TCR), специфичные для SIINFEKL (в связи с Н-2К б). Из этих мышей ОТ-I / Luc, экспрессирующих люциферазы, ОТ-я CD8 + Т-клетки могут быть выделены и подготовлены для передачи в приемной наивных мышей C57BL / 6. После семенами, успешное иммунизация OVA-наночастиц приведет к расширению переданных Т-клеток, которые можно отслеживать с помощью мониторинга сигнал биолюминесценции с всей системы формирования изображений животных 9,10. Это неинвазивный метод визуализации всего тела был использован с другими вирусными или опухолевых антигенов в прошлом 18-20, выявление процессов, участвующих в разложении Т клеток в лимфоидных тканей и распространения в периферических тканях в продольном образом.
В дополнение к анализу адаптивно переданных антиген-специфических CD8 + Т-клеток, endogenoСША T-клеточные ответы после вакцинации могут быть рассмотрены с пептидом главного комплекса гистосовместимости (МНС) тетрамер анализа 21, в котором тетрамер комплекс пептид-МНС, состоящая из четырех флуорофора с метками МНС-молекул класса I, загруженной с пептидных эпитопов, используют чтобы связать TCR и этикеток CD8 + Т клеток в антиген-специфическим образом. Пептид-МНС тетрамер анализ может выполняться либо в терминальных вскрытии исследований для выявления антиген-специфических CD8 + Т-клеток в лимфоидных и периферических тканях или в продольных исследованиях с мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных от последовательный забор крови. После окрашивания лимфоцитов с пептид-МНС тетрамер, проточной цитометрии анализа выполняется для детального анализа на фенотип ЦТЛ или количественной оценки их частоты среди CD8 + Т-клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол в этой статье описан синтез и характеристику новой липидной основе системы наночастиц, называемый ICMVs, и обеспечивает процесс проверки эффективности вакцинных препаратов на основе наночастиц, чтобы вызвать антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы. Синтез ICMV завершена во …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения предоставлять 1K22AI097291-01 и Национального центра Продвижение поступательного наук Национальных Институтов Здоровья в премии Количество UL1TR000433. Мы также признаем, профессор Даррелл Ирвайн в Массачусетском технологическом институте и профессор Маттиас Стефана в Фреда Хатчинсона онкологический центр за их вклад в первоначальной работы по наночастиц вакцин и OT-I / Luc трансгенных мышей.
Materials
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 mL glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125W/20kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo |
References
- Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
- Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
- Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
- Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
- Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
- Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
- DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
- Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
- Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
- Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
- Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
- Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
- Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
- Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
- Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
- Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771 (2012).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765 (2013).
- Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F., Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. , 476-502 (2009).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740 (2008).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
- Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
- Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
- Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
- Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
- Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
- Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
- Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
- Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
- Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
- Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
- Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
- Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
- Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
- Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
- Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105 (2013).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627 (2014).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).
