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Abstract
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Immunology and Infection

Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l'antigène de cellule après nanoparticules vaccination

Published: April 29, 2015
doi:
10.3791/52771
,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Michigan, 2Biointerfaces Institute,University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering,University of Michigan

Summary

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Abstract

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Introduction

Développement traditionnel de vaccin a principalement utilisé l'approche empirique de l'essai-erreur. Cependant, avec le développement récent d'un large éventail de biomatériaux et de découverte de déterminants moléculaires de l'activation immunitaire, il est maintenant possible de concevoir rationnellement des formulations de vaccins avec des indices biophysiques et biochimiques dérivées d'agents pathogènes 1,2. En particulier, diverses plates-formes de distribution de médicaments particulaires ont été examinés en tant que supports de vaccins, car ils peuvent être co-chargés avec des antigènes de sous-unités et agents immunostimulants, protéger les composants du vaccin contre la dégradation, et de renforcer leur collaboration livraison à cellules présentatrices d'antigène (CPA) résidant dans la lymphe nœuds (LNS), maximisant ainsi la stimulation et l'activation immunitaire 3-5. Dans ce rapport, nous décrivons la synthèse d'un système de nanoparticules "pathogène imitant", appelé interbilayer réticulé vésicules multilamellaires (ICMVs), qui ont déjà été démontrées comme un platfor de vaccin puissantm pour le déclenchement de solide lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et des réponses immunitaires humorales dans les deux compartiments de tissus muqueux et systémiques 9.6. En particulier, la vaccination avec ICMVs atteint des niveaux d'IgG sérique sensiblement améliorée contre un antigène de la malaria, par rapport à la vaccination avec des adjuvants classiques (par exemple, l'alun et Montanide) 7 et également provoqué des réponses CTL puissantes contre les cellules tumorales et des modèles de provocation virale chez la souris 9. Ici, en utilisant ICMVs comme un système de nanoparticules de vaccin de modèle, nous décrivons des procédés de caractérisation de vaccins nano-formulations, y compris la taille des particules et des mesures de potentiel zêta et le suivi du trafic de particule de ganglions drainants (DLNS) en utilisant l'imagerie confocale des tissus cryosectioned 7. En outre, nous présentons une méthode d'analyse de l'expansion de réponses CTL chez des souris après le transfert adoptif de lymphocytes T CD8 + spécifiques de l'antigène exprimant la luciférase basé 9,10-imagerie-ensemble des animaux. Enfin, nous avons describe coloration tétramère de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) pour la quantification longitudinal de réponses de cellules T endogènes dans les souris vaccinées avec des nanoparticules 6,9.

ICMVs sont une formulation de nanoparticules à base de lipides synthétisés par fusion contrôlée de liposomes multilamellaires à des structures simples, qui sont ensuite stabilisés chimiquement par des groupes de reticulation tête de phospholipides à fonction maléimide à l'intérieur de couches lipidiques avec des agents de reticulation 6 dithiol. Une fois ICMVs sont synthétisés, une petite fraction de nanoparticules peut être utilisée pour déterminer la taille des particules et le potentiel zêta (c.-à-charge de surface des particules) d'un système de diffusion de lumière dynamique (DLS) et un analyseur potentiel zêta. DLS mesure les changements dans la diffusion de lumière dans des suspensions de particules, permettant de déterminer le coefficient de diffusion et la taille hydrodynamique des particules 11. Atteindre la taille des particules cohérente de lot à la synthèse des lots est essentielleétant donné que la taille des particules est un des principaux facteurs qui influent sur ​​le drainage lymphatique de particules de vaccin à DLNS et l'absorption cellulaire ultérieur par des APC 12,13. En outre, le potentiel zêta peut être obtenue par mesure de la vitesse des particules quand un courant électrique est appliqué, ce qui permet la détermination de la mobilité électrophorétique des particules et la surface de la charge particulaire 11. Assurer des valeurs de potentiel zêta de particules cohérentes est important car la charge de surface des particules détermine la stabilité colloïdale, ce qui a un impact direct sur ​​la dispersion de particules pendant le stockage et après l'administration in vivo 14,15. Afin de suivre la localisation des particules à DLNS, ICMVs peuvent être marquées par des fluorophores désirés, y compris les colorants lipophiles et les antigènes de façon covalente-marqués. Après immunisation, les souris peuvent être euthanasiés à différents points dans le temps, DLNS réséqués, cryosectioned, et analysées par microscopie confocale. Cette technique permet de visualiser drai lymphatiquening des deux porte-vaccins de nanoparticules et de l'antigène à DLNS. Les sections de tissu peuvent en outre être colorés avec des anticorps marqués par fluorescence et utilisé pour obtenir plus d'informations, tels que les types de cellules associées à l'antigène et la formation de centres germinatifs comme nous l'avons indiqué précédemment 7.

Une fois la synthèse des particules est optimisée et le trafic aux DLNS est confirmé, il est important de valider le déclenchement de l'expansion dans vivo de CTL. Afin d'analyser le déclenchement des cellules spécifiques de l'antigène T CD8 + en réponse à la vaccination de nanoparticules, nous avons utilisé un antigène modèle, l'ovalbumine (OVA), avec de l'OVA 257-264 peptide (SIINFEKL) d'un epitope immunodominant de cellule T CD8 +, ce qui permet des analyses immunologiques détaillées des réponses de cellules T spécifiques de l'antigène pour 16,17 initiale de développement d'un vaccin. En particulier, pour interroger la dynamique d'expansion et de la migration des cellules spécifiques de l'antigène T CD8 +, nous avons généré unmodèle de la double-souris transgénique en traversant la luciférase de luciole exprimant souris transgéniques (Luc) avec des souris transgéniques OT-I qui possèdent des cellules avec le récepteur des cellules T (TCR) spécifique pour SIINFEKL (en association avec H-2K b) T CD8 +. A partir de ces souris OT-I / Luc, exprimant la luciférase, les cellules OT-I T CD8 + peuvent être isolées et préparées pour le transfert adoptif dans des souris C57BL / 6 naïves. Une fois ensemencée, l'immunisation réussie avec des nanoparticules contenant OVA se traduira par l'expansion des cellules T transférées, qui peuvent être suivis en surveillant le signal de bioluminescence avec un ensemble de 9,10 Système d'imagerie par animal. Cette technique d'imagerie du corps entier non invasif a été utilisé avec d'autres antigènes viraux ou tumoraux dans le passé 18 à 20, les processus impliqués dans l'expansion des cellules T dans les tissus lymphoïdes et la diffusion dans les tissus périphériques de manière longitudinale révélateur.

Complémentaire à l'analyse des adoptive cellules spécifiques de l'antigène transférés T CD8 +, endógenoles réponses des lymphocytes nous T après la vaccination peut être examiné avec le complexe peptide-complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de dosage de tétramère 21, dans lequel un complexe tétramère peptide-CMH, composé de quatre fluorophore marqués MHC-molécules de classe I chargé avec des epitopes peptidiques, est utilisé à lier le TCR et l'étiquette des cellules T CD8 + d'une manière spécifique à un antigène. L'essai de tétramère MHC-peptide peut être effectuée soit dans des études d'autopsie terminaux afin d'identifier les cellules T CD8 + spécifiques de l'antigène dans les tissus périphériques et lymphoïde ou dans des études longitudinales avec des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) obtenues à partir de sang en série tire. Après coloration des lymphocytes avec un peptide tétramère MHC, la cytométrie en flux analyse est effectuée pour des analyses détaillées sur le phénotype des CTL ou la quantification de leur fréquence chez les cellules T CD8 +.

Protocol

Toutes les expériences décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité de l'Université sur l'utilisation et l'entretien des animaux (UCUCA) à l'Université du Michigan et réalisés selon les politiques et les lignes directrices établies. 1. Synthèse et caractérisation de ICMVs Co-chargé avec de la protéine antigène et adjuvant Molécules Mélanger 1: 1 de rapport molaire de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC…

Representative Results

Les étapes impliquées dans la synthèse de ICMVs sont illustrés sur la figure 1 6. En bref, un film lipidique contenant des médicaments lipophiles ou des colorants fluorescents est hydraté en présence de médicaments hydrophiles. Les cations divalents, tels que Ca2 +, sont ajoutés pour conduire la fusion de liposomes anioniques dans des vésicules multilamellaires. Dithiol agent de reticulation, tel que le DTT, est ajoutée aux lipides à fonction maléimide "discontinu…

Discussion

Le protocole fourni dans cet article décrit la synthèse et la caractérisation d'un nouveau système de nanoparticules à base de lipides, appelé ICMVs, et fournit le processus de validation efficacité des formulations de vaccins à base de nanoparticules à induire CD8 + réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène. Synthèse ICMV est terminée dans tous les état ​​aqueuse, qui est un avantage majeur par rapport aux autres systèmes couramment utilisés polymères de nanoparticules (par …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par l'Institut national de la santé accorde 1K22AI097291-01 et par le Centre national pour l'avancement des sciences translationnelle des Instituts nationaux de la santé en vertu Prix Nombre UL1TR000433. Nous reconnaissons également professeur Darrell Irvine au MIT et professeur Matthias Stephan au Fred Hutchinson Cancer Center pour leur contribution sur le travail initial sur les nanoparticules de vaccins et les souris transgéniques OT-I / Luc.

Materials

1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 mL glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125W/20kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo
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Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).
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