Summary

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Published: April 29, 2015
doi:

Summary

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Abstract

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Introduction

Traditionele ontwikkeling vaccin is vooral in dienst van de empirische benadering van trial-and-error. Echter, met de recente ontwikkeling van een breed scala van biomaterialen en de ontdekking van moleculaire determinanten van immuunactivatie is het nu mogelijk om rationeel ontwerpen vaccinformuleringen met biofysische en biochemische signalen afkomstig van pathogenen 1,2. In het bijzonder hebben verschillende deeltjes drug delivery platforms onderzocht als vaccin dragers als ze kunnen samen worden geladen met subunit antigenen en immuunstimulerende middelen, vaccin componenten te beschermen tegen afbraak, en het vergroten van hun co-levering aan antigen presenterende cellen (APC's) die in lymfe nodes (LNS), waardoor het maximaliseren immuunstimulatie en activering 3-5. In dit rapport beschrijven we de synthese van een "pathogeen-nabootsen" nanodeeltjes systeem, genaamd interbilayer-verknoopt multilamellaire blaasjes (ICMVs), die al eerder hebben aangetoond als een krachtige vaccin platform voor uitlokken van krachtige cytotoxische T lymfocyt (CTL) en humorale immuunresponsen bij zowel systemische als mucosale weefselcompartimenten 6-9. In het bijzonder, de gerealiseerde vaccinatie met ICMVs aanzienlijk serum IgG niveaus versterkt tegen een malaria-antigeen, in vergelijking met vaccinatie met conventionele adjuvantia (bijvoorbeeld, aluin en Montanide) 7 en ook opgewekt potente CTL-responsen tegen tumorcellen en virale uitdaging modellen in muizen 9. Hier, met behulp van ICMVs als model vaccin nanodeeltje systeem beschrijven we methoden voor de karakterisering van het vaccin nano-formuleringen, met inbegrip van de deeltjesgrootte en zetapotentiaal metingen en het bijhouden van de deeltjes mensenhandel aftappen LNS (DLNS) gebruik te maken van confocale beeldvorming van cryosectioned weefsels 7. Bovendien presenteren we een hele dier imaging-gebaseerde werkwijze voor het analyseren expansie van CTL-responsen bij muizen na adoptieve overdracht van luciferase-expressie antigeenspecifieke CD8 + T-cellen 9,10. Ten slotte hebben we deschrijver tetrameer kleuring van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) voor longitudinaal kwantificatie van endogene T cel responsen in muizen gevaccineerd met nanodeeltjes 6,9.

ICMVs zijn een lipide-gebaseerde nanopartikelformulering gesynthetiseerd door gecontroleerde fusie van eenvoudige liposomen in multilamellaire structuren, die vervolgens chemisch worden gestabiliseerd door verknoping-maleïmide gefunctionaliseerde fosfolipide kopgroepen binnen lipide lagen met dithiol crosslinkers 6. Zodra ICMVs worden gesynthetiseerd, kan een klein deel van nanodeeltjes worden gebruikt om deeltjesgrootte en zeta potentiaal (bijv oppervlaktelading van de deeltjes) met dynamische lichtverstrooiing (DLS) systeem en een zeta potentiaal analyzer bepaald. DLS maatregelen veranderingen in de lichtverstrooiing in deeltjessuspensies, waardoor de bepaling van de diffusiecoëfficiënt en de hydrodynamische grootte van de deeltjes 11. Het bereiken van consistente deeltjesgrootte van partij tot partij synthese is van cruciaal belangaangezien deeltjesgrootte een van de belangrijkste factoren die van invloed lymfatische drainage vaccin deeltjes DLN en daaropvolgende cellulaire opname door APCs 12,13. Bovendien kan zeta potentiaal worden verkregen door meting van de deeltjessnelheid bij een elektrische stroom wordt aangelegd, met behulp waarvan de elektroforetische mobiliteit van deeltjes en deeltjes oppervlaktelading 11 toelaat. Consistente zeta potentieel waarden van de deeltjes is belangrijk omdat oppervlakte lading van de deeltjes bepaalt colloïdale stabiliteit, die een directe impact op deeltjesdispersie tijdens opslag en na de in vivo toediening 14,15 heeft. Om het deeltje lokalisatie DLN's volgen, kan ICMVs met de gewenste fluoroforen zoals lipofiele kleurstoffen en covalent gelabeld antigenen worden geëtiketteerd. Na immunisatie kunnen muizen worden gedood op verschillende tijdstippen DLN gereseceerd, cryosectioned en geanalyseerd met confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van lymfatische draining van zowel de nanodeeltjes vaccin vervoerders en antigeen DLN. De weefselcoupes kunnen bovendien worden gekleurd met fluorescent gemerkte antilichamen en gebruikt om meer informatie te verkrijgen, zoals soorten cellen verbonden met het antigeen en de vorming van germinale centra zoals we eerder hebben 7 getoond.

Zodra het deeltje synthese wordt geoptimaliseerd en handel met de DLN wordt bevestigd, is het belangrijk uitlokken van in vivo CTL expansie valideren. Om uitlokken van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen te analyseren in respons op nanodeeltjes vaccinatie hebben we een model antigeen, ovalbumine (OVA) gebruikt, met OVA peptide 257-264 (SIINFEKL) immunodominante CD8 + T-celepitoop, dat gedetailleerde immunologische analyses toelaat antigeen-specifieke T cel responsen voor de eerste vaccinontwikkeling 16,17. In het bijzonder om de dynamiek van expansie en migratie van antigeen-specifieke CD8 + T-cellen ondervragen, hebben we gegenereerd eendubbel transgeen muismodel door kruising firefly luciferase-expressie transgene muizen (Luc) met OT-I transgene muizen die CD8 + T-cellen met T-celreceptor (TCR) specifiek voor SIINFEKL (in samenwerking met H-2Kb) bezitten. Uit deze OT-I / Luc muizen-luciferase expressie, OT-I CD8 + T-cellen kunnen worden geïsoleerd en voorbereid voor adoptieve overdracht naïeve C57BL / 6-muizen. Eenmaal gezaaide zal succesvolle immunisatie met OVA bevattende nanodeeltjes resulteren in uitzetting van de overgedragen T-cellen, die kunnen worden gevolgd door het volgen van de bioluminescentie signaal met een geheel dier beeldvormingssysteem 9,10. Deze niet-invasieve whole-body imaging techniek is gebruikt met andere virale en tumor antigenen in het verleden 18-20, openbaren processen van T-cel expansie in lymfoïde weefsels en verspreiding perifere weefsels in een longitudinale wijze.

Aanvullende analyses van adoptief overgedragen antigeenspecifieke CD8 + T-cellen, endogenoons T cel responsen na vaccinatie kunnen worden onderzocht met peptide-major histocompatibility complex (MHC) tetrameer assay 21, waarbij een peptide-MHC tetrameer complex, bestaande uit vier-fluorofoor gelabeld MHC-klasse I moleculen geladen met peptide-epitopen wordt toegepast TCR label en CD8 + T-cellen binden in een antigeen-specifieke wijze. Het peptide-MHC tetrameer assay kan worden uitgevoerd in terminal necropsie onderzoeken antigeen-specifieke CD8 + T-cellen in lymfoïde en perifere weefsels te identificeren of longitudinale studies met perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) verkregen uit seriële bloedafnames. Na kleuren lymfocyten met peptide-MHC tetrameer, flowcytometrie analyse uitgevoerd voor gedetailleerde analyses op het fenotype van CTLs of kwantificatie van de frequentie tussen CD8 + T-cellen.

Protocol

Alle experimenten beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door de Universiteit Comité voor gebruik en onderhoud van Dieren (UCUCA) aan de Universiteit van Michigan en uitgevoerd volgens het vastgestelde beleid en richtlijnen. 1. Synthese en karakterisering van ICMVs Co-geladen met eiwitantigeen en Adjuvant Moleculen Meng 1: 1 molaire verhouding van 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N – [4- <em…

Representative Results

De stappen betrokken bij de synthese van ICMVs zijn aangegeven in figuur 1 6. Kort wordt een lipide film die één lipofiele geneesmiddelen of fluorescente kleurstoffen gehydrateerd in aanwezigheid van hydrofiele geneesmiddelen. Divalente kationen, zoals Ca2 +, worden toegevoegd om fusie van anionische liposomen multilamellaire vesicles rijdt. Dithiol crosslinker, zoals DTT, is op "nieten"-maleïmide gefunctionaliseerde lipiden toegevoegd op apposing lipide lagen, en ten …

Discussion

Het protocol in dit artikel beschrijft de synthese en karakterisering van een nieuwe lipide-gebaseerde nanodeeltjes systeem, genaamd ICMVs en geeft het proces valideren doeltreffendheid van nanodeeltjes gebaseerde vaccinpreparaten antigeen-specifieke CD8 + T-cel responsen te induceren. ICMV synthese in elke waterige toestand, hetgeen een belangrijk voordeel ten opzichte van andere gebruikelijke polymere nanodeeltjes systemen (bijvoorbeeld poly (lactide-co-glycolide) zuurdeeltjes), die typisch vereist organische…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door het National Institute of Health verlenen 1K22AI097291-01 en door het National Center for Advancing Translationeel Wetenschappen van de National Institutes of Health onder Award Number UL1TR000433. We hebben ook erkennen Prof. Darrell Irvine aan het MIT en Prof. Matthias Stephan bij Fred Hutchinson Cancer Center voor hun bijdrage aan de eerste werkzaamheden op het vaccin nanodeeltjes en OT-I / Luc transgene muizen.

Materials

1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 mL glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125W/20kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo

References

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771 (2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765 (2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F., Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. , 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740 (2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105 (2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627 (2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Play Video

Cite This Article
Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).

View Video