This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.
As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.
секвенирования следующего поколения (NGS) клинических образцов онкологическими становится все более широкое распространение в течение последних нескольких лет, как рост научных точек литературы о важности выявления генетических изменений наведения и прогнозирующие / прогностических молекулярных маркеров. Multi-ген панели анализирует и целые секвенирование экзома исследования в обоих эпителиальных 1,2 и гематологические 3 злокачественных опухолей укрепили концепцию опухоли неоднородности и клоновых эволюции , как болезнь прогрессирует и рецидивы. Кроме того, в отличие от конкурирующих технологий , таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или Sanger секвенирования, НГС может обнаружить большинство геномных изменений во всех клинически значимых генов рака в одном анализе 4.
Центр диагностики Персонализированные первоначально запущен с двумя клиническими NGS панелями, сделанными на заказ Гематологический Panel (Гем-NGS панель) и выключенного готовые панели рака для образцов FFPE (Solid-NGS панели) (см <strong> Рисунок 1). Эти панели покрывают клинически значимые или высокие процентные участки выбранных генов; не все гены или экзоны полностью покрыты. Ампликоны генерируются путем гибридизации зонда с последующим расширением и перевязки. Целевые регионы дополнительно усиливаются с помощью ПЦР с универсальными двойственных индексированные праймеров, что позволяет до 96 образцов должны быть объединены для секвенирования.
Рисунок 1:. Список Гены , охваченного в панели подготовки библиотеки осуществляется с использованием либо пользовательских Гематологический Panel (Панель Гем-NGS) из 33 генов или вне-полки Amplicon Рак панели (Solid-NGS) из 47 генов. Не все гены или экзонов покрыты в полном объеме, так как некоторые ампликонов может охватывать только определенные точки доступа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этого рисунка. </ А>
Содержание для Гем-NGS панель была получена из нескольких источников, но сосредотачивается вокруг 16 генов мутировал в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) , описанной ранее , как демонстрируют высокий уровень клинической полезности 5. Solid-NGS Панель серийно выпускаемых с целевых регионах на основе широко мутировавших генов рака , как сообщалось в каталоге соматические мутации в раковых заболеваний (COSMIC) базы данных 6.
Несколько ключевых шагов характеризуют общий рабочий процесс для клинических NGS. После того, как врач приказывает испытание, патологоанатом определяет адекватность образца для анализа следующих процентах опухолей и объема образца. В нашем учреждении, мы требуем, по крайней мере, 10% опухоли из-за скорости фон секвенирования ошибки ( "шум") технологии и эффективности целевого подхода. Если ткань достаточно для тестирования, геномную ДНК экстрагируют. Эту ДНК затем подвергают многократному контролю качества (QC) шаги. Если ДНК проходит контроль качества, библиотека ампликона генерируется и секвенировали. Полученные данные анализируются через трубопровод биоинформатики в доме. После анализа биоинформатики, варианты вручную рассмотрены и интерпретированы для патогенности перед введением в клинический отчет. Ниже мы опишем два случая, которые прошли через этот строгий рабочий процесс и в конечном итоге привело к изменениям в клиническом лечении.
Случай 1 – острый миелоидный лейкоз
Биопсия костного мозга у пациента был для диагностики ОМЛ без созревания. Цитогенетические исследования были направлены на образец костного мозга и показали нормальную женскую кариотип. Были 95% циркулирующего Взрывы представляют, поэтому периферийную образец крови был послан для персонализированного диагностического тестирования на Гем-NGS панели.
Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) является гематологической злокачественной миелоидного происхождения белых кровяных клеток. обнаружениегенных мутаций в борьбе с отмыванием денег приобретает все большее значение для прогноза и лечения, с рецидивирующим генные мутации признаны важными в патогенезе и прогнозе 7. Мутации в NPM1 и CEBPA были связаны с благоприятным прогностическим риском, в то время как внутренние тандемные дупликации (СДМТ) в FLT3 были связаны с менее благоприятным исходом 8. Все больше доказательств поддерживает патогенную роль для этих и других мутаций в борьбе с отмыванием денег 9.
Случай 2 – легких Аденокарцинома
Биопсия левой надключичной массы от пациента B продемонстрировали легочной аденокарциномы. Биопсийного материала из залитой в парафин (FFPE) масса лимфатических узлов, фиксированных формалином был отправлен для геномного тестирования (панель Полупроводниковый NGS) в виде рулонов / завитки с более чем 50% опухолей, чтобы определить, была ли мутация присутствует для целенаправленного терапевтического вмешательства.
Lung ОТМэр является ведущей причиной смертности, связанной с раком в Соединенных Штатах и делится на два основных типа, немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) и рака легких мелкоклеточный (МРЛ). НМКРЛ может быть дополнительно определен как или аденокарцинома или плоскоклеточный рак, на основании гистологического исследования пораженного участка. Lung аденокарциномы является наиболее распространенным подтипом рака легких, видел как у курящих и некурящих, и является наиболее распространенной формой рака легких для некурящих 10. Молекулярные исследования аденокарциномы легких выявили мутации в нескольких онкогенов 11. Наиболее распространенные мутации драйверов , выявленные у курильщиков являются мутации в KRAS и BRAF. Наиболее распространенные мутации в некурящие являются мутации в EGFR и перегруппировки с участием генов ALK, RET и ROS1. Опухоли легких были описаны с экзон 20 вставки в рамке считывания в гене ERBB2 (HER2 / NEU). Наиболее распространенной аномалией в HER2 / Neu происходит усиление этого локуса при раке молочной железы , для которых целевая терапия доступна (трастузумаб: гуманизированное моноклональное антитело против HER2 / Neu). HER2 / Neu экзон 20 вставки , что наблюдается в 2 – 4% от легкого adenocarcimomas 12 показал частичный ответ на комбинированной терапии с HER2 / Neu и ингибиторы МРМ (neratinib и Темсиролимус, соответственно) 13.
Поскольку два NGS испытания, описанные в этой рукописи предлагаются клинически, наиболее важным практическим фактором является контроль качества. В частности, близко внимание должно быть уделено качеству и количеству извлеченной ДНК. Это особенно важно для образцов FFPE, которые часто сильно деградировали с выходом переменной ДНК. Метод осаждения изопропанолом был разработан с целью максимального выхода ДНК из образцов FFPE, как были найдены способы столбцов на основе иногда приводят к стрижке ДНК с ограниченными объемами элюирования. Таким образом, большую часть времени, когда образец дает слишком низкую концентрацию или слишком деградировали для анализа, то, скорее всего, из-за размера ткани, типу или фиксации, а не процесс экстракции. Для получения образцов крови / костного мозга, если есть сбой в добычу полезных ископаемых, как правило , из – за образце hemodilute (т.е., не имея достаточного количества белых кровяных или опухолевых клеток в этом розыгрыше) или химио абляции.
. Нт "> Во время проверки, отсечек на приемлемость качества и количества ДНК должны быть установлены Рекомендуемый вход 100 – 250 нг часто используется в анализе, однако, если качество ДНК хорошо, то более низкие входные суммы могут быть успешными. Кроме того, если качество ДНК бедна (то есть, количество укрупнения ДНК составляет менее 100 – 250 нг) , то более высокие количества входных может улучшить качество результатов секвенирования (так как количество укрупнения ДНК достигнет заданной входной) . Метрики для качества и количества ДНК должны быть применены к каждому образцу , прежде чем перейти ДНК в подготовке к библиотеке. Эти образцы в "серой зоне" (смотри рисунок 2) должны выполняться по усмотрению директора лаборатории или исполняющему. в настоящее время лучший способ предсказать, если ДНК не будет хорошо работать во время последовательности является выполнение КПЦР на основе анализа на который позволяет для количественной оценки и оценки качества входных ДНК. Этот подход устраняет bioavailability разного размера фрагментов в образце, путем усиления различных размеров фрагментов (например, 100 б.п., 150 б.п., 200 б.п. и 300 б.п.) и сравнения доходности.В настоящее время подготовка библиотека включает в себя большое количество ручных шагов, где неверный шаг в одном из нескольких стыках может привести к библиотеке либо выходят из строя или быть низкого качества. Анализ Микрожидкостных гель является единственным шагом QC для проверки вопроса библиотека приготовительную перед тем секвенирования. Соответственно, существует несколько важных шагов, где дополнительные осознанность могут увеличить вероятность успешной реакции. Крайне важно, чтобы гарантировать правильный образец и олигонуклеотидный пула используются для каждого образца. Обеспечение и правильной записи, что каждый образец содержит один из 96 уникальных комбинаций пар двойственных индексированные праймеров ПЦР уменьшает шанс перепутать образца. Кроме того, важно обеспечить фильтрационную планшету (FPU) истощает правильно; если он не сливает воду должным образом, это может привести к EXTEnsion-лигирование этап подготовки библиотеки для выполнения неоптимально и привести к ухудшению качества данных секвенирования. После того, как библиотеки QC, важно, чтобы гарантировать, что LNB1 гранулы полностью ресуспендировали и что раствор LNB1 / LNA1 хорошо перемешиваются, прежде чем добавить к образцам, как концентрация этой смеси используется для определения молярность библиотеки. И, наконец, если этап шарик элюирование приводит к неоптимальным количеством библиотеки элюирование от бусинки это уменьшит плотность кластеров и, возможно, привести к тому, чтобы библиотека не получить адекватную средний охват. С другой стороны, избыток библиотеки приведет к более низкое качество чтения. Поэтому, важно быть последовательным в бисерной основе нормализации шага для обеспечения оптимальной скапливание и кластеризацию библиотек на секвенсор.
В дополнение к подготовке библиотеки, она имеет решающее значение для проверки биоинформатики трубопровода, который будет производить точные вызовы мутации из сырья, де-уплотненный fastq файлов. Выборпользовательское решение может занять много времени, поскольку есть много с открытым исходным кодом и коммерчески доступные каппы, вариант вызывающих абонентов, а также программные пакеты NGS, которые можно было бы просеивать. Пользовательские алгоритмы должны быть разработаны, чтобы извлечь необходимые статистические данные по эффективности, выявить уникальные повторяющиеся мутации, которые ускользали инструменты наиболее открытым исходным кодом, а также определить статус числа копий по каждому из локусов. Во время процесса валидации биоинформатики трубопровода, важно определить отчетных отсечек для вариантов , которые соответствуют или превосходят как минимальную глубину покрытия после фильтрации качества (например, минимум 250 прочтений) и частоту минимального аллель (например, 4 %). С этого мультиплексной анализа ампликонов на основе, важно , чтобы определить , минимальная средняя глубина охвата (например, 1,000x) , что библиотека должна достичь , чтобы иметь возможность получить самую низкую выполняя ампликона на минимальную глубину читает. Кроме того, мультиплексированный характер анализа делает CAUSE от целевых эффектов и эти «артефакты» должны быть открыты и полностью проверены перед запуском. Другим важным ограничением для описанного анализа потребность в образцах, чтобы содержать более чем 10% опухолей с целью достижения проверенную минимальной частоты аллеля.
Обнаружение низкой частоты, 1%, Flt3 вставках доказательства того, что руководство обзор по – прежнему желательно в этом процессе. Даже при частоте аллеля отсечке 5%, некоторые важные мутации, возможно, пропустили и, таким образом, ручной обзор будет иметь важное значение для выяснения этих вариантов. Для FLT3-СДМТ, визуальный осмотр экзона 14 выполняется для всех больных ОМЛ , чтобы обеспечить низкий уровень или большой вставки / дублирования не остается незамеченным. Кроме того, к HER2 экзон 20 Вставки, которые обычно рядом с часть последовательности праймера, требуют вмешательства. Несмотря на наличие надежного трубопровода биоинформатики, некоторые варианты могли бы пойти упускать из виду что только природа с трудом вырезатьвыкл для большинства статистика упоминалось выше. Лучше биоинформатики было бы необходимо, чтобы помочь решить эту проблему, как будет лучше библиотека методологии подготовки и / или секвенирования, потому что это более выгодно иметь хорошие качественные данные даже при более низких обрезаний, которые содержат меньше артефактов и ложных срабатываний.
Обнаружение и интерпретация частот аллелей может быть затруднено из-за трудностей в определении процентного опухоли и смещения усиления некоторых областей генома. Кроме того, частота аллели более 50% могут быть обнаружены, как это наблюдается в случае 2. Это интерпретируется как потеря гетерозиготности (LOH) событий, либо из-за потери нормального аллеля, что приводит к очевидному увеличению мутанта читает, А усиление мутантной аллели (например, 2 мутанта и одна нормальная копия) или другие механизмы. Эти механизмы могут быть выяснены путем использования массива сравнительную геномную гибридизацию (aCGH 19) и / или SNP массив генотипирования. 20.
Существующие методики целевого обогащения полагаются на полный рабочий день процедур либо неэффективного гибридного захвата или уплотненных методов ПЦР, которые приводят к необходимости более секвенирования охвата одного образца и более от целевой последовательности читает. Дополнительные приложения для NGS молекулярной онкологии ожидается в ближайшем будущем будет включать в себя более простые методы библиотеки подготовки , которые могут быть полностью автоматизированы и быть в состоянии обрабатывать образцы с очень низким количеством входных ДНК (т.е. менее 1 нг), а также образцы с сильно деградировали ДНК. Для решения этих проблем, большинство методов предположительно будет на основе ПЦР, либо будучи многоступенчатым подходом ПЦР или массово-параллельной singleplex ПЦР подход. Кроме того, молекулярная Barcoding отдельных ампликонов было показано, значительно уменьшить фоновый шум и секвенирования позволит испытания образцов с более низкой долей опухолевых клеток для достижения более низких частот аллеля и двигаться в направлении захвата circulatИНГ опухолевых клеток.
Обнаружение связанных с заболеванием мутации в образцах рака был стандартом лечения в течение многих десятилетий. Исторически сложилось так, гены часто испытания последовательно, один ген / экзон в то время, с идентификацией мутации, приводящей к концу тестовой последовательности. Появление NGS позволило менее предвзятый подход к секвенирования нескольких генов, связанных с большим количеством раковых образований параллельно ведущих к идентификации нескольких мутаций, которые связаны с неоплазии. Клиническая полезность NGS для выявления соматических мутаций при раке становится все более очевидным. Действительно, NGS на основе анализа образцов опухолей представляет собой новую парадигму, которая бросает вызов традиционной тестирования отдельных генов, но клиническая полезность очень ясна. Клинические лаборатории сегодня имеют прекрасную возможность Wed тщательной проверки метода и интерпретации тестового с применением этой мощной технологии.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить за помощь Дэниела Wild для чтения рукописи и помощь в производстве.
Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technology | 5067-5365 | |
Genomic DNA Reagents | Agilent Technology | 5067-5366 | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technology | 5067-5584 | |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technology | 5067-5585 | |
TapeStation 2200 | Agilent Technology | G2965A | |
TapeStation Analysis Software | Agilent Technology | A.01.04 or higher | |
96-well Tube Storage Racks | Any Vendor | ||
15/50 ml Tube Rack | Any Vendor | ||
96-well Plate Rack | Any Vendor | ||
Pipette, single-channel, 0.5–2.5 μL | Any Vendor | ||
Pipette, single-channel, 1–10 μL | Any Vendor | ||
Pipette, single-channel, 2–20 μL | Any Vendor | ||
Pipette, single-channel, 10–100 μL | Any Vendor | ||
Pipette, single-channel, 20–200 μL | Any Vendor | ||
Pipette, single-channel, 100–1000 μL | Any Vendor | ||
Serological Pipettor | Any Vendor | ||
Vortexer | Any Vendor | ||
Ice bucket | Any Vendor | ||
Microcentrifuge (for tubes and strip tubes) | Any Vendor | ||
Freezer, -20 °C | Any Vendor | ||
4 °C Refrigerator | Any Vendor | ||
Water or Bead Bath | Any Vendor | ||
Incubator (37 oC) | Any Vendor | ||
Serological Pipettes, 1 mL | Any Vendor | ||
Serological Pipettes, 5 mL | Any Vendor | ||
Serological Pipettes, 10 mL | Any Vendor | ||
Serological Pipettes, 25 mL | Any Vendor | ||
Gloves | Any Vendor | ||
Razor Blades/Scaples | Any Vendor | ||
KimWipes | Any Vendor | ||
15 mL Conical Tube | Any Vendor | ||
50 mL Conical Tube | Any Vendor | ||
Paper Towels | Any Vendor | ||
200 proof Ethanol | Any Vendor | Store in Flammable Cabinet | |
2-Propanol (Isopropanol) | Any Vendor | Store in Flammable Cabinet | |
25ml Reservoirs | Any Vendor | ||
10N NaOH | Any Vendor | ||
Pipette, 8-channel, 1–10 μL | Any Vendor | ||
Pipette, 8-channel, 10–100 μL | Any Vendor | ||
Pipette, 8-channel, 20–300 μL | Any Vendor | ||
Ice Bucket | Any Vendor | ||
Water Squirt Bottle | Any Vendor | ||
Alcohol Squirt Bottle | Any Vendor | ||
Lens Cleaning Paper | Any Vendor | ||
Plates, 96-well PCR, Semi-Skirted | Any Vendor | ||
Tube strips, 8-well, 0.2 mL | Any Vendor | ||
Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
BioShake IQ or 3000-T elm | Bulldog Bio/Q.Instruments | 1808-0506/ 1808-0517 | |
DropPlate96 S – LabChipDS | Caliper | 128876 | |
DropPlate96 D – LabChipDS | Caliper | 132848 | |
DropSense96 | Caliper (Trinean) | ||
DropQuant Software | Caliper (Trinean) | ||
Plate Sealing Film | Denville | B1212-5S | |
Aluminum Seal Foil | Denville | B1212-6S | |
Nuclease-Free, Pure Water System | EMD Millipore | ||
5424 centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 | Both 15 ml tube and plate rotators, preferably a centrifuge that can go up to 2,500 x g. |
Safe-Lock Tube 1.5 mL, Natural | Eppendorf | 22431021 | |
5 mL Tube, DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108310 | |
5430R Centrifuge | Eppendorf | 022620645 | Any plate rotator centrifuge will work |
Hybex Microsample Incubator | Fisher Scientific | 1057-30-0 | |
Hybex 0.2 mL Tube Block | Fisher Scientific | 1057-31-0 | |
TruSeq Amplicon – Cancer Panel | Illumina | FC-130-1008 | 96 reactions |
TruSeq Custom Amplicon | Illumina | PE-940-1011 | 96 reactions |
TruSeq Custom Amplicon Index Kit | Illumina | FC-130-1003 | 96 Indices, 384 Samples |
MiSeq Reagent Kit v3, 500 Cycles | Illumina | MS-102-3003 | |
MiSeq Reagent Kit v2, 300 Cycles | Illumina | MS-102-2002 | |
MiSeq Reagent Kit v2, 500 Cycles | Illumina | MS-102-2003 | |
Experiment Manager | Illumina | 1.3 or higher | |
MiSeq Reporter | Illumina | 2.0 or higher | |
Sequencing Analysis Viewer | Illumina | 1.8 or higher | |
TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit | Illumina | FC-130-1007 | |
MiSeq v2 | Illumina | SY-410-1003 | |
TruSeq Custom Amplicon Filter Plate | Illumina | FC-130-1006 | |
Index Adapter Replacement Caps | Illumina | 11294657 | |
Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
Qubit 0.5 ml Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | |
DynaMa6-96 Magnetic Stand, Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | |
GeneAmp PCR System 9700 (gold/silver block) | Life Technologies | N8050200 | |
Gentra Puregene Blood Kit | Qiagen | 158489 | |
Deparaffinization Solution (16ml) | Qiagen | 19093 | |
Buffer ATL (4x50ml) | Qiagen | 939011 | |
Protein Precipitation Solution (50 ml) | Qiagen | 158910 | |
DNA Hydration Solution (100ml) | Qiagen | 158914 | |
Glycogen Solution (500 μl) | Qiagen | 158930 | |
Qiagen Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
Rnase (5ml) | Qiagen | 158924 | |
Nuclease-Free Water (10 x 50 ml) | Qiagen | 129114 | |
Pestles | USA Scientific | 1415-5390 | |
TipOne RPT 10 ul elongated filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips). | USA Scientific | 1180-3810 | |
TipOne RPT 100 ul natural, beveled filter pipet tips in sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-1840 | |
TipOne RPT 200 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-8810 | |
TipOne RPT 20 μl natural, beveled filter pipet tips in racks, sterilized racks, 10 racks of 96 tips (960 tips) | USA Scientific | 1180-1810 | |
TipOne RPT 1000 μl natural, graduated XL filter pipet tips in | USA Scientific | 1182-1830 |