Выделение перитонеальных макрофагов Carry Out Gene Expression анализ По Toll-подобные рецепторы стимуляции
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
Во-инфекции и воспаления, циркулирующих моноцитов оставить кровоток и мигрируют в ткани, где они дифференцируются в макрофаги. Макрофаги экспрессируют поверхностные Toll-подобные рецепторы (TLR,), которые распознают консервативные молекулярные модели в процессе эволюции в широком диапазоне микроорганизмов. TLRs играть центральную роль в активации макрофагов, которые, как правило, связанные с изменением экспрессии генов. Макрофаги имеют решающее значение при многих заболеваниях и появились как привлекательных объектов для терапии. В следующем протоколе мы опишем процедуру, чтобы изолировать перитонеальных макрофагов с помощью тиогликолята среду пивные. Последнее будет стимулировать миграцию моноцитов в брюшину, соответственно это повысит макрофагов выход 10-кратным. Несколько исследований было проведено с использованием костного мозга, селезенки или перитонеальные макрофаги происходит. Тем не менее, перитонеальные макрофаги было показано, что более зрелые при отрыве и более стабильны по своим функциональнымность и фенотип. Таким образом, макрофаги, выделенные из мышиного брюшную полость представить важную клеточной популяции, которые могут служить в различных иммунологических и метаболических исследований. После выделения макрофаги стимулировали различными лигандами TLR и, следовательно, экспрессии генов оценивали.
Introduction
Ретикулоэндотелиальной фагоцитарной система состоит из клеток различных тканей и органов, таких как костный мозг, кровь, печень и селезенка. Макрофаги широко распространены по всему телу, где они особенно участие в врожденного и адаптивного иммунного ответа для управления и ясные инфекции. В дополнение к их роли в защите организма, макрофаги, также играют важную роль в заживлении ран и в поддержании гомеостаза тканей 1,2. Кроме того, макрофаги важны не только для иммунной функции, но также активно участвовать в гомеостазе железа 3. В организме, примерно 80% железа присутствует в гемоглобина в эритроцитах, что при стареющей фагоцитированы макрофагов 4. Ежедневно эти макрофаги перерабатывать 25 мг эритроцитов, полученных железа и обеспечить его транспортировку в плазме 5. Кроме того, во время инфекции и воспаления, провоспалительных макрофагов секвестр сывороточного железа восстановления железа Доступностти к патогенам, как на системных и местных уровнях 6-8. Кроме того, исследования показали, что макрофаги и главным гепатоциты производят антимикробного пептида по имени гепсидин, что считается главный регулятор метаболизма железа 9, 10. Гепцидин в основном увеличился на воспалительные стимулы и частично отвечает за поглощения железа в макрофагах при хроническом воспалении 11-13. Как гепсидин выражение в макрофагах не очень хорошо понял, мы изучали возможную роль Toll-подобные рецепторы (TLR,) в этом регулировании. В первую очередь TLRs найти на макрофагах и играют центральную роль в их активации. Кроме того, ЛПС индуцированных гепсидин выражение в печени зависит от TLR4 13. Поэтому, чтобы выполнить наше исследование, мы использовали метод, основанный на выделении мышиных перитонеальных макрофагов.
Линии макрофагов клеток широко используются в макрофагов шпильких годов; тем не менее, расширенная культура может спровоцировать потерю гена и снижением иммунных функций в этих клеточных линий. Таким образом, выделение макрофагами брюшную полость имеет решающее значение.
Мышь брюшной полости представляет собой идеальное место, чтобы урожай макрофаги 13-15. Изолированные мышиные перитонеальные макрофаги удобны в течение нескольких исследований, касающихся их иммунологической функции. Тем не менее, количество макрофагов в брюшной полости недостаточно для обширных исследований и, по оценкам около 1 × 10 6 на мышь макрофаги. Таким образом, чтобы повысить выход макрофагов, стерильный вызывая агент, такой как тиогликолята вводили в брюшную полость, предшествующий урожай клеток. После инъекции тиогликолята, выход макрофагов на мышь была увеличена в 10 раз. Несмотря на увеличение урожайности, макрофагов тиогликолята среднего актов пивные как раздражитель, который вызывает воспалительную реакцию, в результате найма макрофагов, которые мау, но не нужно влиять на экспрессию генов. Следовательно, контрольная группа, состоящая из необработанными макрофагами должны быть включены в каждом эксперименте. В наших руках, гепсидин выражение, которое высоко стимулируется воспаления не был обнаружен в необработанной тиогликолята вызвало перитонеальные макрофаги. Кроме того, исследования показали, что тиогликолята Пивные новобранцев многочисленные макрофаги, но не активирует их 16. С другой стороны, тиогликолевой Пивные вызвало макрофаги показали увеличение фермента лизосом, а снижение убивает микроорганизмы проглатывании 17. Тем не менее, фагоцитарная способность не влияет, по сравнению с не-макрофагов вызвало 16.
После культивируют в чашках, в перитонеальные макрофаги становятся присоединенными, тем самым возможность их отделения от других типов клеток, выделенных из брюшной полости. Впоследствии, выделенных макрофагах заражали различными агонистами TLR,.Наконец, мРНК экстрагировали из культивированных клеток и экспрессии генов был проанализирован с использованием количественной обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции (QRT-PCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Макрофаги имеют решающее значение для выживания и обеспечить заманчивой целью манипулировать хост для иммунологических целей. Открытие TLRs и других молекул распознавания провели макрофаги к центру иммунологической дискуссии. Макрофаги отвечают на множество стимулов, в том числе цит?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом от естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады (NSERC, не дают никаких 298515-2011). Л. является получателем к.т.н. Стипендия от естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады (NSERC), и MS была поддержана грантом от от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR, грант №. MOP123246).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
- Pollard, J. W. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
- Koury, M. J., Ponka, P. New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron. Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).
- Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism. J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).
- Hershko, C. Storage iron regulation. Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).
- Collins, H. L. Withholding iron as a cellular defence mechanism–friend or foe. Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).
- Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism. Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).
- Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice. Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).
- Zumerle, S., et al. Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype. Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).
- Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein. Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).
- Nemeth, E., et al. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization. Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).
- Constante, M., et al. Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J Vis Exp. (35), (2010).
- Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages. Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).
- Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes. Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).
- Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).
- Layoun, A., Santos, M. M. Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling. Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).
- Oppenheim, J. J., Yang, D. Alarmins: chemotactic activators of immune responses. Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124 (4), 783-801 (2006).
- Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10. J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).
- Wang, C., et al. Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14 (6), (2013).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).
- Wang, Y., Harris, D. C. Macrophages in renal disease. J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).
- Schleicher, U., Bogdan, C. Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages. Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).
