쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기
Summary
We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
Abstract
감염과 염증 동안, 순환 단핵 세포는 혈류를 떠나 그들이 대 식세포로 분화 조직으로 이동한다. 마크로파지는 미생물의 광범위한 발전을 통해 보존 된 분자 패턴을 인식 표면 수신자 같은 수용체 (TLR들)을 표현한다. TLR에 보통 유전자 발현의 변화와 연관된 대 식세포의 활성화에 중요한 역할을 담당한다. 대 식세포는 많은 질병에 중요하며 치료를위한 매력적인 대상으로 등장했다. 다음의 프로토콜에서는 맥주의 매체를 이용하여 티오 글리콜 레이트 뮤린 복막 대 식세포를 분리하는 과정을 설명한다. 후자는 이에 따라이 10 배 식세포 수율을 올릴 것이다, 복막에 단핵 세포 마이그레이션을 높일 것입니다. 몇몇 연구는 골수, 비장 또는 복막 대 식세포 유래를 사용하여 수행되었다. 그러나, 복강 대 식세포는 분리에 따라 더 성숙한 것으로 나타났다과 기능에 더 안정되었다성만 및 표현형. 따라서, 쥐의 복강에서 분리 한 대 식세포는 다른 면역 및 대사 연구에서 봉사 할 수있는 중요한 세포 집단을 제시한다. 격리되면 대 식세포는 다른 TLR 리간드로 자극하고, 결과적으로 유전자 발현을 평가 하였다.
Introduction
세망 내피 식세포 시스템은 골수, 혈액, 간 및 비장 등의 다양한 조직 및 기관에서의 세포로 구성된다. 대 식세포는 광범위하게 그들은 특히 타고난에 참여하고 제어하는 면역 반응과 명확한 감염을 적응 적 신체, 주위에 분포한다. 숙주 방어에서의 역할뿐만 아니라, 대 식세포는 상처 치유 및 조직 1,2- 항상성 유지에 중요한 역할을한다. 또한, 대 식세포는 면역 기능 만 중요한 것이 아니라 적극적으로 철 항상성 3에 참여한다. 체내에서 철의 약 80 %가 노화가 4 대 식세포에 의해 포식되고있는 경우에는, 적혈구 내의 헤모글로빈에 존재한다. 매일, 이러한 대 식세포는 적혈구 유래 철의 25 mg의 재활용 및 플라즈마 (5)에 자사의 전송을 제공한다. 또한, 감염 및 염증 동안 대 식세포 염증성 철 availabili 감소 혈청 철을 격리시키는모두 전신 및 지역 수준 6-8에서 병원균에 타이. 대 식세포 주로 간세포 철 대사 (9), (10)의 마스터 조절기 간주됩니다 hepcidin라는 항균 펩타이드를 생산하는 것이 아니라 연구는 보여 주었다. Hepcidin은 주로 염증 자극에 의해 증가 및 만성 염증 11 ~ 13시 대 식세포 철 격리 부분적으로 책임이있다. 대 식세포에 hepcidin 표현이 잘 이해되지 않습니다, 우리는이 규정에 수신자 같은 수용체의 가능한 역할 (TLR들)을 공부했다. TLR에 주로 대 식세포에서 발견되고 그들의 활성화에 중심적인 역할을한다. 또한, 간에서의 LPS 유도 hepcidin 식 TLR4 (13)에 의존한다. 따라서, 우리의 연구를 실행하도록, 우리는 뮤린 복막 마크로파지의 분리에 기초한 방법을 사용 하였다.
대식 세포주 대체로 대식 스터드에 이용된다이거; 그럼에도 연장 배양 유전자의 손실을 야기하고 이러한 세포주에서 면역 기능을 저하 할 수있다. 따라서, 복강 대 식세포에서의 분리는 매우 중요하다.
마우스 복강 대 식세포 13-15을 수확 할 수있는 이상적인 위치를 제공합니다. 고립 된 쥐의 복강 대 식세포는 면역 기능에 관한 여러 연구 편리합니다. 그러나, 복막의 대 식세포의 수가 방대한 연구 불충분하고, 마우스 당 약 1 × 106 식세포를 추정한다. 따라서, 대 식세포의 출력을 높이기 위해, 예컨대 티오 글리콜 레이트와 같은 멸균 제는 유도 세포 수확 직전 복강 내로 주사 하였다. 티오 글리콜 레이트 주사 후, 마우스 당 식세포의 수율은 10 배 증가 하였다. 대 식세포 수율, 대 식세포의 모집, 엄마의 결과, 염증 반응을 유도하는 자극으로 맥주의 티오 글리콜 레이트 배지 행위의 증가에도 불구하고그러나 Y 불필요 유전자 발현에 영향을 미친다. 따라서, 비 처리 된 대 식세포로 구성된 대조군이 각각의 실험에 포함되어야한다. 우리의 손에, 높은 염증에 의해 자극 hepcidin 표현은 복막 대 식세포를 이끌어 비 처리 티오 글리콜 레이트 검출되지 않았다. 또한, 연구는 맥주의 티오 글리콜 레이트가 많은 대 식세포를 모집하지만 그들에게 (16)을 활성화하지 않는 것으로 나타났습니다. 한편, 맥주의 티오 글리콜 레이트는 대 식세포는 리소좀 효소의 증가하지만 섭취 미생물을 죽이는 17의 감소를 유발 하였다. 비 – 유도 대 식세포와 비교할 때 16 그러나, 탐식 능력은 영향을받지 않았다.
접시에서 배양하면, 복막 마크로파지 따라서 복강으로부터 분리 된 세포의 다른 유형에서 자신의 분리를 허용 부착된다. 이어서, 절연 식세포 다른 TLR에 작용 제로 감염시켰다.마지막의 mRNA는 배양 된 세포로부터 추출하고, 유전자 발현은 정량적 역전사 – 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)을 이용하여 분석 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
대 식세포는 생존을 위해 매우 중요하다 및 면역 학적 목표에 대한 호스트를 조작 할 수있는 유혹 대상을 제공합니다. TLRs를 인식하고 다른 분자의 발견은 면역 논쟁의 중심 대 식세포를 수행 하였다. 대 식세포는 사이토 카인, 손상 관련 분자 패턴 분자 (감쇠) (20)과 병원균 (PAMPs가) 21 그룹과 연관된 분자를 포함한 다양한 자극에 반응한다. 이러한 다양한 자극 응답은 대 식세포의 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다 (NSERC, 더 298515-2011을 부여하지 않음). AL은 박사 학위를받는 사람입니다 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 및 MS에서 장학금 (, 아니 부여합니다. MOP123246 CIHR) 건강 연구의 캐나다 연구소에서 교부금에서 지원되었다.
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
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