We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.
感染症や炎症の間、循環単球は、血流を離れ、彼らはマクロファージに分化する組織へと移行します。マクロファージは、微生物の広い範囲の進化を通じて保存された分子パターンを認識し、表面のToll様受容体(TLR)を発現します。 TLRは、通常、遺伝子発現の変化に関連しているマクロファージの活性化において中心的な役割を果たしています。マクロファージは、多くの疾患において重要であり、治療のための魅力的な標的として浮上しています。以下のプロトコルでは、我々はビールチオグリコール酸培地を用いてマウスの腹腔マクロファージを単離するための手順が記載されています。後者は、それに応じて、これは10倍マクロファージ収量を発生させます、腹膜への単球の移行を後押しします。いくつかの研究は、骨髄、脾臓または腹腔由来マクロファージを用いて行われてきました。しかし、腹腔マクロファージは、分離の際に、より成熟したことが示されており、それらの機能に、より安定しているし、性と表現型。このように、マウスの腹腔から単離されたマクロファージは、異なる免疫学的および代謝の研究に役立つことができる重要な細胞集団を提示します。単離されると、マクロファージは、異なるTLRリガンドで刺激し、その結果、遺伝子発現を評価しました。
細網内皮系の貪食は、骨髄、血液、肝臓および脾臓のような種々の組織および器官中の細胞から構成されています。マクロファージは広く、彼らは特に制御する自然免疫と適応免疫応答と明確な感染症に関与体の周りに分布しています。宿主防御におけるそれらの役割に加えて、マクロファージはまた、創傷治癒および組織の恒常性1,2-維持に重要な役割を果たしています。さらに、マクロファージだけでなく、免疫機能に重要であるだけでなく、積極的に鉄ホメオスタシス3に参加しています。本体では、鉄の約80%は、老化がマクロファージ4によって貪食される赤血球内のヘモグロビンに存在します。毎日、これらのマクロファージは赤血球由来の鉄25mgをリサイクルし、プラズマ5にその輸送を提供しています。また、感染および炎症の間、前炎症性マクロファージ鉄availabiliを減少させるために血清鉄を封鎖します両方の全身および地域レベル6-8で病原体へのTY。マクロファージおよび主に肝細胞が鉄代謝9、10のマスターレギュレーターであると考えられるヘプシジンという名前の抗菌ペプチドを生成することだけでなく、研究が示されています。ヘプシジンは、主に炎症性刺激によって増加し、慢性炎症11-13時のマクロファージにおける鉄の隔離のために部分的に責任があるされています。マクロファージにおけるヘプシジンの発現は非常によく理解されていないとして、我々はこの調節におけるToll様受容体(TLR)の役割の可能性を検討しました。 TLRは主にマクロファージで発見し、それらの活性化において中心的な役割を果たしています。また、肝臓におけるLPS誘導性のヘプシジン発現は、TLR4 13に依存しています。したがって、我々の研究を実行するために、我々は、マウスの腹腔マクロファージの単離に基づく方法を使用していました。
マクロファージ細胞株は広くマクロファージスタッドに使用されていますIES;それにもかかわらず、拡張培養は、遺伝子の損失を誘発し、これらの細胞株における免疫機能を低下させることができます。このように、腹腔からマクロファージの単離は非常に重要です。
マウス腹腔マクロファージ13-15を収穫するのに理想的なサイトを紹介します。単離されたマウス腹腔マクロファージは、その免疫学的機能に関するいくつかの研究のために便利です。しかし、腹膜におけるマクロファージの数は、鋭意研 究のために不十分であり、マウス当たり約1×10 6のマクロファージが推定されます。したがって、マクロファージの出力を上げるために、例えば、チオグリコール酸のような滅菌誘発剤は、細胞の収穫の前に腹腔内に注射しました。チオグリコレート注射後、マウスのマクロファージあたりの収量は10倍増加しました。マクロファージ収量、マクロファージの動員、マサチューセッツ州で、その結果、炎症反応を誘導する刺激としてビールチオグリコール酸培地行為の増加にもかかわらず、Yが、必須ではないが、遺伝子発現に影響を与えます。したがって、未処理マクロファージからなる対照群を各実験に含めなければなりません。私たちの手で、非常に炎症によって刺激されるヘプシジン発現は、非処置チオグリコール酸では検出されなかった腹腔マクロファージを誘発しました。また、研究では、ビールチオグリコール酸は、多数のマクロファージを動員するが、それらに16を活性化しないことが示されています。一方、ブリューワーのチオグリコール酸は、マクロファージは、リソソーム酵素の増加が、摂取した微生物17を殺すの減少を示した誘発しました。非誘発マクロファージ16と比較した場合しかし、貪食能は影響を受けませんでした。
皿で培養した後、腹腔マクロファージは、したがって、腹膜腔から単離された細胞の他のタイプからそれらの分離を可能にする、接着性になります。続いて、単離されたマクロファージは、異なるTLRのアゴニストで攻撃しました。最後に、mRNAを培養細胞から抽出し、遺伝子発現は、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(QRT-PCR)を用いて分析しました。
マクロファージは、生存のために重要であり、免疫学的目的のためのホストを操作するための魅力的な標的を提供します。のTLRおよび他の認識分子の発見は、免疫学的議論の中心にマクロファージを行いました。マクロファージは、サイトカイン、ダメージ関連分子パターン分子(DAMPS)20および病原体(のPAMPs)21のグループに関連する分子を含む種々の刺激に応答します。?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会(NSERC、何の298515から2011を付与していない)からの助成金によってサポートされていました。 ALは博士の受信者であります自然科学とカナダの工学研究評議会(NSERC)から奨学金、およびMSは、カナダ衛生研究所からの助成金からサポートされていました(無許可、CIHR。MOP123246)。
C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
70% ethanol | |||
10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
20g and 23g needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
Scissor | |||
Forceps | |||
50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
Refrigerated centrifuge | |||
Hemocytometer | |||
F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
Flow Cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
Six-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
TRIZOL | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |