Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup> 2+</sup> Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
Kalsiyum vasküler dokularda çok sayıda fizyolojik süreçte önemli bir düzenleyicidir. En endotel ve düz kas fonksiyonları yüksek hücre içi kalsiyum ([Ca2 +] i) ve nitrik oksit (NO) değişikliklere bağlıdır. Amacıyla iki foton mikroskobu ile boyaları [Ca 2 +] i, NO ve alt molekülleri vazokonstriktörlere ve vazodilatörler yanıt olarak bir kan damarı tarafından işlenir, biz kalsiyum etiketleme geçerli yeni bir teknik (ya da NO-etiketleme) geliştirdi nasıl anlamak için İzole kan damarlarındaki kalsiyum taşıma (veya NO üretimini) ölçmek için. Burada anlatılan sıçan, etiket kalsiyum veya HAYIR endotel veya düz kas hücrelerinin içinde aort izole ve görüntü kalsiyum geçici (veya HAYIR üretim) fizyolojik aşağıdaki iki foton mikroskop kullanarak nasıl gösterir bir ayrıntılı adım-adım prosedürü ya da farmakolojik uyaranlar. yöntemi kullanmanın yararları çok yönlüdür: 1) aynı anda mümkündürly endotel hücreleri ve farklı uyarıcılara tepki olarak, düz kas hücreleri, hem de geçici kalsiyum ölçülmesi; 2) görüntü, endotelyal hücreler ve nativ ortamda düz kas hücrelerinin bir sağlar; 3) Bu yöntem hücre içi kalsiyum veya HAYIR değişiklikler ve hassas ölçümler için yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir karşı çok hassastır; ve 4) tarif edilen yaklaşımı, bu reaktif oksijen türleri gibi diğer moleküller, ölçümü için uygulanabilir. Özetle, iki foton lazer emisyon mikroskobu uygulama geçici kalsiyum ve izole bir kan damarı endotel ve düz kas hücrelerinde NO üretimini yüksek kalitede nicel verilerin sağlanan ve vasküler fonksiyonları düzenleyen mekanizmaların anlayışımızı teşvik etmiştir izlemek için.
Introduction
Kalsiyum, endotel ve düz kas hücreleri gibi vasküler hücreler içinde temel bir ikinci mesajcı olan. Bu vasküler kasılma için birincil uyaran ve endotel içinde YOK nesil yoluyla etkileri de dahil olmak üzere, vasküler dilatasyon önemli bir rol oynamaktadır. Nedeniyle görüntüleme teknolojilerinin sınırlamaları nedeniyle, sağlam geminin içinde kalsiyum işleme gözlemlemek neredeyse imkansız olmuştur. İki foton görüntüleme sistemleri ve yeni kalsiyum yaratılması veya HAYIR etiketleme boyalarının geliştirilmesi, kalsiyum dinamikleri ve damarsal içinde NO üretimini anlamaya başlamak için yeterli derinlik ve çözünürlükte görüntü mümkün kılar.
İki foton mikroskop son zamanlarda doku, organ ve çünkü derinden düşük eşiğe ve yüksek sinyal duyarlılığı ile dokulara nüfuz üstün yeteneği bile tüm hayvan çalışmalarında uygulanmıştır. 1,2 illuminat iki foton uyarma dar spektrumluiyon odak noktası olan ve olmayan descanned dedektörlerin kullanımı iki foton mikroskopi geleneksel konfokal mikroskobu üstündür nedenleri vardır. Mikroskopisi nedeniyle oto-floresan ve konfokal iğne deliği içine out-of-focus ışık saçılması için gerekli doku derinlikte yüksek kaliteli görüntüler üretemez. Sonuç olarak, [Ca2 +] i sinyal ölçmek için iki foton mikroskopu kullanılarak bir yöntem ve yüksek bir çözünürlüğe ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip olduğu gibi, tek tek kan taşıyıcı hücrelerin NO üretimi geliştirdik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deneysel Bakış. Daha iyi damar fizyolojisi HAYIR kalsiyum katkısını anlamak ve için, yeni bir yöntem ölçmek için geliştirilen [Ca 2 +] i ve NO düz kas ve izole bozulmamış aorta endotel hücreleri içinde. 1) Mekanik izolasyon ve hazırlık (enzimatik olmayan sindirim) Geminin: Birlikte, bu protokol bu kritik adımlardan oluşur. Optimum fizyolojik kayıtları elde etmek mümkün olduğunca sağlıklı ve sağlam dokuyu tutmak önemlidir. Pluronik asit ile 2) kalsiyum etiketle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz görüntüleme çalışmaları ile yardım için Dr. William Cashdollar ve Wisconsin Kan Araştırma Enstitüsü'nde Kuzeybatı Karşılıklı Vakfı Görüntüleme Merkezi'ni teşekkür ederiz. Biz de bu yazının ve yararlı bir tartışma eleştirel okuma Dr Daria Ilatovskaya teşekkür ederim. Bu çalışma (AS) Sağlık Hibeler HL108880 National Institutes ve (AMG için) DP2-OD008396 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM – a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
