Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
סידן הוא רגולטור חשוב מאוד של תהליכים פיסיולוגיים רבים ברקמות כלי דם. רוב פונקציות אנדותל ושריר החלק תלויות במידה רבה בשינויים בסידן תוך תאי ([Ca 2 +] i) ותחמוצת חנקן (NO). על מנת להבין כיצד [Ca 2 +] אני, לא ומולקולות במורד הזרם מטופלות על ידי כלי דם בתגובה לvasoconstrictors ומרחיבי כלי דם, שפיתחנו שיטה חדשנית שחלה בסידן תיוג (או אי-תיוג) צובע עם שתי מיקרוסקופיה הפוטון כדי למדוד טיפול סידן (או ייצור NO) בכלי דם בודדים. שתואר כאן הוא הליך צעד-אחר-צעד מפורט המדגים איך לבודד את אב העורקים מעכברוש, סידן תווית או NO בתאי האנדותל או שריר חלק, וסידן תמונה ארעיים (או ייצור NO) באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים הבאים פיסיולוגי או גירויים תרופתיים. היתרונות של שימוש בשיטה הנן רב-פי: 1) זה אפשרי בו זמניתly למדוד ארעיים סידן בשני תאים אנדותל ותאי שריר חלק בתגובה לגירויים שונים; 2) זה מאפשר לתאי האנדותל תמונה ותאי שריר חלק בהגדרה האם שלהם; 3) בשיטה זו היא רגישה מאוד לסידן תוך תאי או ללא שינויים ומייצר תמונות ברזולוציה גבוהות למדידות מדויקות; ו -4 גישה מתוארת) יכולה להיות מיושמת למדידה של מולקולות אחרות, כגון מיני חמצן תגובתי. לסיכום, יישום של מיקרוסקופיה פליטת לייזר שני פוטונים כדי לפקח ארעיים סידן ואין ייצור בתאי האנדותל ושריר החלק של כלי דם בודדים סיפק נתונים כמותיים באיכות גבוהה וקידם את ההבנה של מנגנוני ויסות תפקוד כלי דם שלנו.
סידן הוא שליח שני יסודי בתוך תאי כלי דם כגון אנדותל ותאי שריר חלק. זה הגירוי העיקרי להתכווצות כלי דם ומשחק תפקיד מרכזי בהתרחבות כלי דם, כולל ההשפעות שלה שלא בדור בתוך האנדותל. בשל מגבלות של טכנולוגיות הדמיה, זה כבר כמעט בלתי אפשרי להתבונן טיפול סידן בתוך הכלי שלם. הפיתוח של שתי מערכות הדמיה פוטון ויצירת סידן חדש או NO צבעי תיוג, מאפשר תמונה בעומק ורזולוציה מספיק כדי להתחיל להבין את דינמיקת סידן וייצור NO בתוך כלי הדם.
לאחרונה מיקרוסקופ שני פוטונים יושם ברקמות, איברים ומחקרים בבעלי חיים גם כל בגלל היכולת מעולה שלו לחדור לעומק רקמות עם הקרינה רקע נמוכה ורגישות גבוהה אות. 1,2 הספקטרום הצר של שני עירור הפוטון בIlluminatמוקד היון והשימוש בגלאים-descanned הלא הם הסיבות מדוע שתי מיקרוסקופיה הפוטון היא מעולה למיקרוסקופיה confocal המסורתית. מיקרוסקופיה confocal לא יכולה לייצר תמונות באיכות גבוהה בעומק הרקמה ההכרחי בשל אוטומטי הקרינה והפיזור של אור מחוץ למוקד לחריר confocal. כתוצאה מכך, פיתחנו שיטה באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים למדוד [Ca 2 +] אני איתות וייצור NO בתאים שלמים, פרט כלי דם עם רזולוציה גבוהה ויחס אות לרעש נמוך.
הסקירה ניסיונית. כדי להבין טובה יותר את התרומה של סידן ולא לפיזיולוגיה של כלי דם, שיטה חדשה שפותחה למדידה [Ca 2 +] אני ולא בתוך שריר חלק ותאי האנדותל של aortas שלם המבודד. יחד, פרוטוקול זה מורכב משלבים הבאים קריטיים: 1) בידוד והכנה מכאני (עיכול לא האנזימטית) של…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לד"ר ויליאם Cashdollar, ומרכז קרן ההדמיה נורת'ווסטרן ההדדית בדם מכון המחקר של ויסקונסין לעזרה עם בדיקות ההדמיה. כמו כן, אנו מודים לד"ר דריה Ilatovskaya לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה ודיון מועיל. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענקי HL108880 (לAS) וDP2-OD008396 (לAMG).
DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
L-Name | Tocris | 0665 | |
Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
Other basic reagents | Sigma-Aldrich |