细胞内钙的双光子成像<sup> 2+</sup>的离体大鼠主动脉的处理和一氧化氮的内皮细胞和平滑肌细胞
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
钙是许多生理过程中血管组织的一个非常重要的调节器。最内皮细胞和平滑肌功能高度依赖于变化的细胞内钙（[Ca2 +浓度i）和一氧化氮（NO）。为了理解如何的[Ca 2+] i的，编号和下游分子通过响应于血管收缩剂和血管扩张剂的血管进行处理，我们开发了一种适用钙标记的新技术（或NO标签）染料与双光子显微镜衡量钙处理（或NO生产）在离体血管。这里所描述的是一个详细的一步一步的过程，演示如何从大鼠，标签钙或NO内的内皮细胞或平滑肌细胞中分离出的主动脉和图像钙瞬变（或NO生产），使用双光子显微镜下列生理或药物刺激。使用该方法的好处是多方面的：1）能够同时进行LY测量两种内皮细胞和平滑肌细胞响应于不同的刺激钙瞬变; 2）它允许一个图像的内皮细胞和平滑肌细胞在其天然设置; 3）该方法是于细胞内钙或NO的变化，并产生高分辨率的图像进行精确的测量很敏感;和4）中描述的方法可以适用于其它分子，如活性氧的测量。总之，应用程序的两个光子激光发射显微镜监测钙瞬变和在一个孤立的血管的内皮细胞和平滑肌细胞的NO产生提供了高品质的量化的数据，并促进了调节血管功能的机制的理解。
Introduction
钙是血管细胞如内皮细胞和平滑肌细胞内的一个基本的第二信使。它是主要的刺激血管收缩和起主要作用于血管扩张，包括通过NO的生成的内皮细胞内的效果。由于成像技术的局限性，它已经几乎不可能完整的容器内观察钙处理。双光子成像系统和建立新的钙或NO标记染料的发展，使得能够对图像以足够的深度和分辨率开始了解钙动力学和脉管系统中NO的产生。
双光子显微镜最近在组织，器官，因为其卓越的能力，深入穿透组织与低背景荧光和高灵敏度的信号，甚至是整个动物研究中得到应用。1,2双光子激发的补偿发光的窄谱离子焦点和使用非退扫描探测器的原因双光子显微镜优于传统共聚焦显微镜。在必要的组织深度由于自发荧光和的离焦的光的散射进共焦针孔共焦显微镜不能产生高质量的图像。因此，我们开发了使用双光子显微镜来测量的[Ca 2+] i的信令和方法在完整的，独立的血管细胞具有高分辨率和低信噪比的NO产生。
Protocol
Representative Results
Discussion
实验概述。为了更好地理解钙的贡献和NO血管生理学，一种新颖的方法测定制定的[Ca 2+] i和编号为内平滑肌和离体完整主动脉内皮细胞。一起，这种协议包括以下关键步骤：1）机械分离和制备（未酶促消化）容器。重要的是要保持组织健康和完好尽可能获得最佳生理记录是重要的。 2）培育在钙 – 标记染料或NO标记染料与聚醚酸是至关重要的，但是，对于某些其它容器的类?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢威廉Cashdollar博士和西北互助基金会影像中心在威斯康星血液研究所的帮助，成像研究。我们也感谢达里娅Ilatovskaya博士这个手稿和有益的讨论，批判性阅读。这项研究是由卫生赠款HL108880国家研究院（以AS）和DP2-OD008396（以AMG）的支持。
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
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