This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
I meccanismi che regolano l'efficacia della selezione timica restano mal definiti. Il metodo qui presentato permette in vivo analisi dello sviluppo e selezione di cellule T specifiche per sé e antigeni estranei. L'approccio prevede l'impianto di innesti timici derivate da diversi topi anziani in riceventi SCID immunodeficienti. Nel corso di un periodo relativamente breve di tempo i destinatari sono completamente ricostituiti con cellule T derivate dal trapianto del timo impiantata. Solo timociti semina timo al momento della selezione subiscono isolamento e svilupparsi in cellule T mature. Come tali, i cambiamenti nella natura e la specificità delle cellule T trapiantate in funzione di eventi timici dipendenti dall'età possono essere valutate. Anche se è richiesta competenza tecnica per il trapianto timica successo, questo metodo fornisce una strategia unica di studiare in vivo una vasta gamma di patologie che sono causa o il risultato di aberrant funzione e / o homeostas timicoè.
Il timo è un organo in cui gli eventi critici nello sviluppo delle cellule T si verificano 1. Timociti residente sul riarrangiamento del recettore delle cellule T (TCR) α e β geni, subiscono una serie di interazioni con lymphostromal e cellule presentanti l'antigene (APC) nelle regioni corticali e midollari del timo 2. Thymic selezione positiva è mediata da cellule epiteliali corticali timici (TEC) per produrre timociti che riconoscono peptidi antigenici nell'ambito dell'ospite classe complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) I e II molecole 2-3. Successivamente timica selezione negativa comporta spurgo dei timociti autoreattivi, guidato da un'interazione con TEC midollare o cellule dendritiche (DC) che presentano peptidi derivati da auto-proteine legate da MHC di classe I e II molecole 3. Il risultato finale di questi processi è la creazione di un pool di cellule mature CD4 + e CD8 + T in grado di rispondere ad un ampio spettrodi antigeni estranei mentre esibendo reattività minima auto-proteine 4.
L'efficienza di eventi di selezione timici è influenzata da una serie di fattori, tra cui la maturazione timica, frequenza midollare e TEC corticale, composizione sottoinsieme di timico DC, e la fonte di precursori timici 3. In particolare, la selezione del timo aberranti può provocare autoimmuni 5 o immunodeficienza patologie che derivano da alterazioni selezione negativa o positiva, rispettivamente. Gli eventi molecolari che regolano la selezione del timo, tuttavia, sono poco conosciuti. In vitro approcci come reaggregate colture d'organo del timo (RTOC) 6, hanno dimostrato di essere utile per analizzare gli eventi di base associate con la selezione del timo, ma non riescono a riassumere pienamente le dinamiche del corso negli eventi vivo. Di conseguenza, questo approccio basato trapianto-timico è stato stabilito a migliori eventi di selezione thymocyte studio in vivo 7 </sup>.
Questo protocollo descrive trapianto thymi da topi donatori neonati e per adulti in immunodeficienti topi riceventi SCID. Questa tecnica permette lo studio dei meccanismi che regolano la selezione timica positiva e negativa, nonché uscita timica di vari sottogruppi di cellule T durante l'ontogenesi. Recentemente, questo approccio è stato utilizzato per dimostrare che l'efficienza della selezione timica è limitato subito dopo la nascita in topi con conseguente aumento sviluppo di cellule T autoreattive e una ridotta repertorio cellule T specifiche per antigeni estranei 7.
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
18 gauge needle | BD | 305195 | |
Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |