Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.
Molte malattie neurologiche progressive negli esseri umani, come l'epilessia, richiedono modelli animali pre-clinici che lentamente si sviluppano la malattia, al fine di verificare gli interventi nelle varie fasi del processo di malattia. Questi modelli animali sono particolarmente difficili da implementare nei roditori immaturi, un organismo modello classico per studio di laboratorio di questi disturbi. La registrazione EEG continuo in giovani modelli animali di epilessia e altri disturbi neurologici rappresenta una sfida tecnica a causa delle ridotte dimensioni fisiche dei giovani roditori e la loro dipendenza sulla diga prima dello svezzamento. Pertanto, non c'è solo una chiara necessità di migliorare la ricerca pre-clinica in grado di meglio individuare le terapie idonee alla traduzione alla clinica, ma anche la necessità di nuovi dispositivi in grado di registrare in continuo EEG nei roditori immaturi. Qui, descriviamo la tecnologia alla base e dimostrare l'uso di un sistema di telemetria in miniatura romanzo, specificamente progettati per l'utilizzo in ratti immaturi otopi r, che è anche efficace per l'uso in animali adulti.
Il più vecchio – e tuttora il più utilizzato – tecnica per la registrazione biopotenziali nel cervello è l'elettroencefalogramma (EEG). È usato clinicamente per alterazioni neurologiche, tra cui il rilevamento sequestro 1, localizzazione del sequestro focolai 2, e la diagnosi di trauma cranico 3,4. Questa tecnica è anche ampiamente usato per fornire informazioni fondamentali sui meccanismi di sonno e per diagnosticare disturbi del sonno 5,6.
Come nella diagnosi clinica delle epilessie, l'EEG è diventato indispensabile per la ricerca traslazionale in modelli animali di epilessia sia genetici e acquisiti. Nelle applicazioni di ricerca in corso, "wired" o registrazioni "legato" sono standard, e vengono regolarmente eseguite in roditori adulti per settimane alla volta 7. Tuttavia, il rumore elettrico, artefatti da movimento, e il rischio che legava animali si ferirà tirando il cavo hanno lunghi compromised questi esperimenti. Così, per migliorare le condizioni e tassi di successo sperimentale, abbiamo bisogno di sviluppare nuove tecnologie che consentano di eliminazione dell'interfaccia cablata tra l'animale e la strumentazione. La zona più evidente di sviluppo è la progettazione e l'implementazione di sistemi di telemetria che consente registrazioni di alta qualità, pur mantenendo una vita utile lunga e riducendo al minimo il disagio per i soggetti animali. La riduzione delle dimensioni fisiche di questi dispositivi permetterà ricerca traslazionale in modelli di roditori neonatali e giovanili di disturbi neurologici.
Basso numero di canali EEG nei ratti sono impiegati ampiamente per lo sviluppo di nuove terapie per sopprimere gli attacchi epilettici in grado di traduzioni per gli esseri umani. Le registrazioni da uno o più siti per un periodo prolungato aprono molte possibilità per l'utilizzo di modelli di roditori di epilessia nella ricerca traslazionale. Gran parte della ricerca contemporanea in questo campo mira a bloccare il verificarsi di Seiz cronicaUres o lo sviluppo di epilessia (ad esempio, epilettogenesi), e tali sforzi di ricerca richiedono ampie se il monitoraggio EEG non continuo per saggiare l'efficacia della terapia proposta 8; un piccolo sistema di telemetria, semplice, con uno, due o quattro canali operativi tra 0.1-100 Hz per canale promuoverà fortemente questo tipo di ricerca traslazionale. Sequestri elettrografici si verificano spesso a comportamenti minimi (certamente senza convulsioni), che limita l'utilità del test basati sui sequestri comportamentali. La strategia di combinare la registrazione EEG e video controllo simultaneo permette la possibilità di catturare ogni sequestro; e, inoltre, questi approcci analitici possono consentire la valutazione quantitativa delle punte interictali che si verificano nel cervello epilettico tra eventi 9 "ictale" (o sequestro). Inoltre, la capacità di ottenere continuo ad alta qualità a basso artefatto EEG registrazioni, per cui la tecnologia wireless è generalmentesuperiore, permetterà lo sviluppo di uso di algoritmi basati su computer per studiare specifiche forme d'onda EEG (ad esempio, theta, gamma), così come il rilevamento automatico di convulsioni, riducendo notevolmente il carico di lavoro dello sperimentatore.
Il modello pre-clinico primario per studiare epilessia cronica dopo una lesione cerebrale è il ratto adulto o il mouse, tramite una chemio-convulsivante (cioè acido kainico o pilocarpina) o stato indotto elettricamente epilettico (SE), che è seguita da epilessia cronica. In queste condizioni, le convulsioni gravi associati SE o successivi convulsioni negli animali epilettiche possono causare lesioni da strappo animale o tirando il tether e allentando le viti che mantengono il fissaggio del headcap. In definitiva, è questo problema che termina di solito questi esperimenti, e tuttavia la necessità di ottenere ad alta risoluzione record EEG a lungo termine per gli esperimenti volti a sviluppare nuove terapie per la cronicaepilessia è fondamentale. Inoltre, l'alloggio, il monitoraggio e l'analisi dei dati provenienti da animali a lungo termine impiantati è un notevole investimento sia dei costi diretti e tempo sperimentatore; Pertanto, risoluzione anticipata del esperimento può comportare costi significativi per i ricercatori. Poiché questi modelli di progresso epilessia, le convulsioni di solito diventano più frequenti e più gravi 10-12, aumentando la probabilità che gli animali sono feriti, così come la loro utilità per lo sviluppo di nuove terapie diventa più grande. Questi animali possono sviluppare sistematicamente decine di attacchi convulsivi al giorno, spesso si verificano in grappoli 13.
Probabilmente uno degli sviluppi più importanti della scienza biomedica è stato l'uso di gene targeting in modelli murini. Questo approccio ha permesso, e continuerà a permettere lo sviluppo di modelli animali di epilessia genetica che riproducono effettivi sindromi umane 14-16. Manipolazioni genetiche possono essere intraprese comeproof-of-principle terapie per sopprimere crisi epilettiche o addirittura bloccare lo sviluppo di epilessia dopo danno cerebrale 17-20. Questo tipo di ricerca beneficerebbe notevolmente da la capacità di eseguire high-throughput registrazione continua della EEG. Attualmente, è possibile registrare da topi sia con sistemi frenati o di telemetria; tuttavia, le sfide di ottenere alta qualità, registrazioni prive di artefatti sono sostanzialmente più difficile che i ratti, e spesso questo richiede varie forme di zaini che i topi continuamente tentano di rimuovere. Lo stress potrebbe aumentare gravità delle crisi, la frequenza e / o durata, e quindi in ultima analisi modificare l'epilessia degli animali da esperimento, confondendo così lo studio. Un piccolo, leggero, low-profile sistema di telemetria in miniatura faciliteranno la registrazione di lungo termine EEG da modelli genetici murini di malattie umane.
In aggiunta ai problemi sopra descritti, la registrazione EEG nel modello di roditore immatures di malattia ha una propria serie di sfide. Animali immaturi possono pesare il meno 6 g (P8 mouse) per 17 g (P6 ratto). E 'praticamente impossibile fare di serie più giorni frenati registrazioni di EEG a causa di un aumento dello stress da cavezza e l'incapacità di permettere all'animale di impennarsi del cucciolo dalla diga. Fino a quando gli animali vengono svezzati, devono rimanere nella cura della diga. La diga è incline a distruggere qualsiasi complesso connettore esteriorizzato sul cucciolo, interrompere il cucciolo, e in alcuni casi terminare l'intera cucciolata. Inoltre, il roditore teschio immaturo rende difficile montare qualsiasi piedistallo elettrodo al cranio con integrità meccanica. Queste sfide, uniche per roditori immaturi, richiedono una nuova soluzione per effettuare registrazioni elettrografiche robusto, lungo termine. Qui ci concentriamo sulla dimostrazione l'impianto e la registrazione di EEG usando un nuovo trasmettitore wireless in miniatura e presenti tre esperimenti proof-of-principio come esempi per l'uso del sistema di telemetria wireless in miniatura: 1) l'immaturo modello di ratto pup di ipossia-ischemia, 2) topi adulti trattati con DFP per indurre lo stato di male epilettico e successive crisi spontanee, e 3) il modello genetico di malformazioni cavernose vascolari che si traducono in convulsioni e morte nei topi adulti.
Il sistema di telemetria wireless in miniatura è stato progettato per soddisfare quattro esigenze principali: (1) impianto chirurgico minimamente invasivo; (2) la compatibilità per l'alloggiamento dei cuccioli roditori con la diga e fratellini; (3) un basso consumo di potenza dell'unità, permettendo così mesi di monitoraggio continuo senza chirurgica reimpianto; e (4) possibilità di registrare forme d'onda EEG di alta qualità con il minimo artefatti da movimento. Il trasmettitore wireless pesa <0.6, 2.3 e 4 g ed è <0,3, 0,8, e 1,4 cm 3 in funzione della batteria con un ingombro di 5 x 7, 7 x 9, o 7 x 12 mm che monta facilmente al cranio dell'animale con gel di cianoacrilato. Senza tasselli osseo sono necessari per apporre saldamente il dispositivocranio, riducendo il numero di fori che devono essere perforati nel cranio e il tempo chirurgico. Il dispositivo è in grado di amplificare due canali di EEG o potenziali di campo locale di strutture cerebrali profonde, come l'ippocampo, per oltre 2 settimane, 2 mesi o 6 mesi in questa configurazione. Le piccole dimensioni del trasmettitore wireless riduce il rischio di infezione, aumenta la mobilità degli animali, e, infine, riduce la morbilità e la mortalità che aumenta in caso contrario il tempo, denaro, e il numero di animali necessari per un esperimento. Tutta l'elettronica e la batteria sono in vaso in resina epossidica medico-grado che rende il dispositivo impermeabile e resistente, impedendo la diga da masticare sul trasmettitore che altrimenti potrebbero rendere il dispositivo inutilizzabile. Diversamente trasmettitori radio-frequenza, il sistema di telemetria utilizza accoppiamento capacitivo tra il trasmettitore ed un'antenna ricevente che si trova sotto la gabbia per animali, permettendo all'utente di mantenere gli animali in abitazioni roditore standard. Più canali di recording consentire la registrazione di biopotenziali multimodali, come elettrocardiogramma e l'elettroencefalogramma. Modelli animali di comorbidità beneficeranno dalla possibilità di registrare biopotenziali durante il comportamento 21-23. La combinazione di comportamento con monitoraggio EEG sarà fornire ai ricercatori uno strumento migliore per la ricerca e gli studi pre-clinici.
Può essere molto costoso per effettuare registrazioni elettrografiche a lungo termine in modelli piccoli animali della malattia. Facendo affidamento su semplici circuiti elettrici ed enfatizzando consumo a bassa potenza, siamo stati in grado di creare un sistema di trasmettitore (figure 1 e 2) che riduce il costo di esperimenti di monitoraggio a lungo termine. Il costo totale di un esperimento di controllo sei mesi potrebbe essere a partire da $ 470, più il costo di un animale (~ 1,5 dollari animale diaria, 200 dollari trasmettitore). Le piccole dimensioni del trasmettitore consente registrazioni continue elettrografiche ininterrotte in piccoli animali, modelli pre-clinici di malattie umane, che sono molto difficili da ottenere con i sistemi di registrazione wireless basati radiofrequenza tethered o (Figura 4). Infine, la natura montato cranio del trasmettitore riduce il tempo di intervento chirurgico e stress sul animale che può altrimenti compromettere un esperimento. Qui vi mostriamo proof-of-principle esperimenti da tre differenti modelli sperimentali di epilessia: perinatale ipossia-ischemia 13, 27, 28 in un cucciolo di ratto (figura 4), epilettico DFP-indotta stato (Figura 5) e convulsioni in un modello geneticamente indotta malformazioni vascolari cavernosi (Figura 6).
Forse l'aspetto più critico per l'ottenimento di registrazioni elettrografiche privo di artefatti, a lungo termine è quello di verificare l'accesso elettrodo disinibito alla regione corticale di interesse (Figura 4-6). Ciò include l'elettrodo comune di riferimento / terra. Particolarmente critico è collegare il trasmettitore al cranio per le applicazioni EEG epidurale. Durante questo processo, è possibile inavvertitamente rivestire la punta degli elettrodi con cianoacrilato data la lunghezza molto breve degli elettrodi. Rivestimento gli elettrodi in cianoacrilato può attenuare le segnali EEG o completamente isolarli nel peggiore dei casi. Allo stesso modo, la mancanza di una buona connessione elettrica bra comune di riferimento / terra e cervello dell'animale impedisce il corretto funzionamento dell'amplificatore differenziale nel trasmettitore, con conseguente elettricamente "noisy" uscita del segnale. Spesso, dopo l'intervento chirurgico, i segnali di buona qualità può essere compromessa per un massimo di 48 ore a causa di un edema che circondano i buchi bave nel cranio. Come l'edema si abbassa, i segnali generalmente migliorano. Ciò può essere evitato inserendo gli elettrodi sulla superficie del cranio senza foratura bave. Le conseguenze di questo processo sono aumentati potenziale per rivestire gli elettrodi con cianoacrilato, una ridotta attività ad alta frequenza a causa dei passa-basso caratteristiche elettriche delle ossa del cranio, e la possibilità di isolare elettricamente il comune di riferimento / terra rumore rendendo nei segnali. Praticando il corretto posizionamento degli elettrodi può essere fatto con un pezzo sottile di legno o impiallacciatura che imita lo spessore del mouse o ratto cranio. I risultati presentati in questo manoscritto illustrano la qualità di registrazioni che si possono ottenere con la tecnologia telemetria wireless.
Impianto chirurgico utilizzando il metodo qui descritto può richiedere un minimo di 10 minuti, a seconda della complessità della chirurgia. Per accesso chirurgico strutture cerebrali profonde, come la regione CA1 dell'ippocampo, è preferibile fissare il trasmettitore ad un micromanipolatore montato su un telaio stereotassico. Il micromanipolatore fornirà il chirurgo con la precisione di impiantare il trasmettitore secondo coordinate stereotassica pubblicati nell'atlante dei topo e ratto 29 30 cervello. Questo può essere fatto semplicemente imbastitura un pezzo di tubo ipodermico al trasmettitore con cianoacrilato e quindi montare il ago ipodermico in micromanipolatore. Controllo micromanipolatore di x, y, e Z fornirà stabilità durante il montaggio del trasmettitore al cranio prima sutura della pelle chiuso. L'aggiunta di viti ossee intorno al perimeter del trasmettitore può contribuire ad ancorare il trasmettitore al cranio, anche se non sono necessarie. Viti ossee potrebbero essere efficaci, tuttavia, in alcuni modelli animali di epilessia ed epilessia, come ratto adulto litio-pilocarpina trattati. Questi animali tendono ad avere convulsioni spontanee con l'attività motoria intensa che potrebbero danneggiare il trasmettitore durante il sequestro. Complessità aggiuntiva potrebbe essere aggiunto a questi esperimenti. Per esempio, il trasmettitore è compatibile con molti modelli differenti di lesioni cerebrali traumatiche, come l'impatto corticale controllato 31. La durata del dispositivo trasmettitore è stato testato da impianto di animali con trasmettitori a P7, e poi li ospita nella struttura animali. Dopo 12 mesi, la maggior parte degli impianti è rimasta intatta sul cranio. Quando gli animali sono stati sottoposti ad eutanasia, i teschi sembrava essere normale e il trasmettitore è stato incorporato nelle ossa del cranio, che richiede una forza notevole per estrarlo. Fare attenzione quando strutture cerebrali profondesono studiati; come il cervello cresce, e gli elettrodi rimane ferma, la posizione finale degli elettrodi si penserebbe che cambiare. Per le tecniche qui descritte, gli elettrodi sono stati generalmente posizionati sopra la dura madre, che ha permesso sia il cervello e il cranio di crescere e per gli elettrodi di rimanere nelle loro posizioni originali. Il fattore limitante in quanto tempo il trasmettitore può essere utilizzato è la dimensione della batteria (vale a dire fino a quando la batteria si esaurisce).
Un design monolitico autonomo (cioè il trasmettitore è incorporato in hard epossidica) di abitazioni del trasmettitore si presta per l'uso con i cuccioli immaturi sono alloggiati con la diga e loro fratellini. Spesso, co-housing impiantato animali con Tethers cablati risultati nella distruzione dell'hardware impiantato o cannibalizzazione dei cuccioli dalla diga. La forma liscia parete del trasmettitore permette per l'impianto praticamente senza guasti hardware o una perdita di cuccioli a causa di cannibalizzazione.
<p class = "jove_content"> Lo schema di trasmissione capacitivo accoppiato a bassa potenza in questo sistema si presta bene per l'impiego in diversi scenari sperimentali, come il posizionamento in un incubatore a temperatura controllata o anche per l'utilizzo con apparati sperimentali, come le camere pletismografia. Analogamente, la forma dell'antenna ricevente può essere manipolata per adattarsi in molti ambienti comportamentali diversi, come l'elevata gamma T-maze.The del trasmettitore a pochi pollici come il trasmettitore deve essere in grado di "guidare" (coppia capacitivamente a) l'antenna ricevente e si basa su l'animale a essere alloggiati in gabbie roditori standard o adatto gabbia coperta dalla superficie antenna ricevente. Il trasmettitore agisce come un polo di un campo elettrico mentre il corpo dell'animale agisce come un altro polo. Il campo è tale che alcuni indirizzi, ad esempio 90 ° fuori fase con l'antenna del ricevitore, non riuscirà a guidare l'antenna ricevente conseguente "drop out". Questo è un evento piuttosto raro. I lavori futuri con questa tecnologia permetterà la registrazione da più animali nella stessa gabbia che ridurrà i costi di imbarco e consentire l'interazione sociale. Ulteriori sviluppi comporteranno l'aumento del numero di canali tra cui la temperatura, e elettromiogramma. Il design attuale del dispositivo fornisce una larghezza di banda che è ottimizzato per la ricodifica di bande EEG classici, che non è adatto per la registrazione di ondulazioni veloci o oscillazioni ad alta frequenza. In futuro, il dispositivo può essere modificato per registrare i componenti ad alta frequenza del segnale, ma a costo di vita della batteria. Diversi tipi di trasduttori comprenderanno pressione sanguigna e pressione-volume, e anche la costruzione di una disposizione degli elettrodi trasmettitore dimensioni specificate dall'utente secondo coordinate stereotassiche delle strutture cerebrali desiderati.The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato attraverso l'Istituto Nazionale di Malattie Neurologiche e Stroke R43 / R44 NS064661.
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