Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.
Veel progressieve neurologische ziekten bij mensen, zoals epilepsie, vereisen preklinische diermodellen die langzaam de ziekte ontwikkelen teneinde interventies in verschillende stadia van het ziekteproces testen. Deze diermodellen zijn bijzonder moeilijk te implementeren in onvolwassen knaagdieren, een klassiek modelorganisme voor laboratoriumonderzoek van deze aandoeningen. Opname continue EEG in jong dier modellen van toevallen en andere neurologische aandoeningen een technisch probleem, vanwege de kleine fysieke afmetingen van jonge knaagdieren en hun afhankelijkheid van de dam tot het spenen. Daarom is er niet alleen een duidelijke behoefte aan verbetering van preklinisch onderzoek dat therapieën die beter geschikt zijn voor vertaling naar de kliniek, maar ook behoefte aan nieuwe apparaten kan opnemen continue EEG bij onvolgroeide knaagdieren identificeert. Hier beschrijven we de techniek achter en demonstreren het gebruik van een nieuw mini telemetriesysteem, speciaal ontworpen voor gebruik bij onvolwassen ratten or muizen, die ook werkzaam is bij volwassen dieren.
De oudste – en nog steeds de meest gebruikte – techniek voor het opnemen biopotentialen in de hersenen het elektro-encefalogram (EEG). Het is klinisch gebruikt voor neurologische afwijkingen, met inbegrip van inbeslagneming detectie 1, lokalisatie van inbeslagneming brandpunten 2, en diagnose van een hersenschudding 3,4. Deze techniek wordt ook veel gebruikt om fundamentele informatie over de mechanismen van de slaap en om slaapstoornissen 5,6 diagnosticeren.
Zoals in de klinische diagnose van epilepsie, heeft de EEG onontbeerlijk voor translationeel onderzoek in diermodellen van zowel genetische en verworven epilepsie worden. In het huidige onderzoek toepassingen, "bedraad" of "tethered 'opnamen zijn standaard, en worden routinematig uitgevoerd bij volwassen knaagdieren wekenlang in een tijd 7. Echter, elektrische ruis, bewegingsartefacten, en het risico dat dieren zich verwonden door aan de kabel vastgemaakt lang compromised deze experimenten. Dus, om het verbeteren van de experimentele condities en slagingspercentages, moeten we nieuwe technologieën die het mogelijk maken voor de eliminatie van de bedrade interface tussen het dier en instrumentatie te ontwikkelen. De meest voor de hand liggende gebied van ontwikkeling is het ontwerp en de implementatie van telemetrie systemen die het mogelijk maakt voor hoge-kwaliteit opnames, met behoud van een lange levensduur en het minimaliseren van ongemak voor dierlijke onderwerpen. Het verminderen van de fysieke grootte van deze apparaten translationeel onderzoek bij neonatale en juveniele knaagdiermodellen van neurologische aandoeningen mogelijk maken.
Lage channel-count EEG-registraties bij ratten worden uitgebreid gebruikt om nieuwe therapieën te ontwikkelen om epileptische aanvallen staat vertaling naar de mens te onderdrukken. Opnamen van de ene of meer plaatsen langdurig opent vele mogelijkheden voor het gebruik knaagdiermodellen van epilepsie bij translationeel onderzoek. Veel van het moderne onderzoek op dit gebied is bedoeld om het optreden van chronische Seiz blokkerengelen of ontwikkeling van epilepsie (bijv epileptogenese) en dergelijke onderzoeksinspanningen dat uitgebreide of niet continu EEG monitoring om de doeltreffendheid van de voorgestelde therapie 8 assay; een kleine, eenvoudige, telemetrische systeem met één, twee of vier kanalen die tussen 0,1-100 Hz per kanaal sterk zal bevorderen dit type van translationeel onderzoek. Elektrografische aanvallen komen vaak met minimale gedrag (zeker zonder convulsies), die de waarde voor assays op basis van gedrags- aanvallen beperkt. De strategie van het combineren van EEG-opname en gelijktijdige video-monitoring maakt het mogelijk de mogelijkheid van het vastleggen van elke beslaglegging; en bovendien kunnen deze benaderingen kwantitatieve beoordeling van de interictale pieken die zich voordoen in de epileptische hersenen tussen "ictal" (of inbeslagneming) evenementen 9 mogelijk te maken. Bovendien is de mogelijkheid voor een constante hoge kwaliteit tegen lage artefact EEG op te kunnen nemen, waarbij de draadloze technologie algemeensuperior, zal voor de ontwikkeling van het gebruik van computer-gebaseerde algoritmen voor het bestuderen van specifieke EEG-golfvormen (bijvoorbeeld theta, gamma), evenals automatische detectie van aanvallen, de werklast van de experimentator aanzienlijk verminderen.
De primaire preklinisch model voor de studie van chronische epilepsie na hersenletsel is de volwassen rat of de muis, hetzij via een chemo convulsieve (bijv kainzuur of pilocarpine) of elektrisch geïnduceerde status epilepticus (SE), gevolgd door een chronische epilepsie. Onder deze omstandigheden kan de ernstige convulsies in verband met SE of de daaropvolgende aanvallen bij de epileptische dieren leiden tot letsel door het dier scheuren of trekken aan de ketting en het losdraaien van de schroeven waarmee de bevestiging van de headcap behouden. Uiteindelijk is dit probleem dat gewoonlijk beëindigt deze experimenten, en toch de noodzaak van langdurige hoge-resolutie EEG records voor experimenten gericht op het ontwikkelen van nieuwe therapieën voor chronische vindenepilepsie staat voorop. Bovendien, huisvesting, monitoring, en analyseren van de gegevens van de lange-termijn geïmplanteerde dieren is een aanzienlijke investering in zowel de directe kosten en onderzoeker tijd; Daarom, voortijdige beëindiging van het experiment leidt tot hoge kosten voor de onderzoekers. Aangezien deze modellen van epilepsie vooruitgang, de aanvallen meestal vaker en ernstiger 10-12 geworden, waardoor de kans dat de dieren gewond, net als hun nut voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën wordt grootst. Deze dieren kunnen routinematig ontwikkelen tientallen convulsieve aanvallen per dag, vaak voorkomen in clusters 13.
Waarschijnlijk een van de belangrijkste ontwikkelingen biomedische wetenschap is het gebruik van gen targeting in muismodellen. Deze benadering is toegestaan, en zal blijven toestaan, de ontwikkeling van dierlijke modellen van genetische epilepsie dat de werkelijke menselijke syndromen 14-16 reproduceren. Genetische manipulatie kan worden uitgevoerd alsproof-of-principle therapieën om epileptische aanvallen te onderdrukken of zelfs blokkeren van de ontwikkeling van epilepsie na hersenletsel 17-20. Dit onderzoek zal sterk profiteren van de mogelijkheid om high-throughput continue registratie van de EEG voeren. Momenteel is het mogelijk om op te nemen van muizen met hetzij vastgemaakt en telemetriesystemen; De problemen van het verkrijgen van hoge kwaliteit, artefactvrij opnamen aanzienlijk moeilijker dan ratten, en dit vergt vaak verschillende vormen van rugzakken die muizen continu proberen te verwijderen. Stress kan aanvallen ernst, de frequentie en / of duur te verhogen, en dus zou uiteindelijk epilepsie van de proefdieren te wijzigen, waardoor de verstorende studie. Een kleine, lichtgewicht, low-profile miniatuur telemetriesysteem zal de opname van de lange termijn EEG van genetische muismodellen van de ziekte bij de mens te vergemakkelijken.
Behalve de hierboven beschreven problemen, opname EEG bij onvolgroeide knaagdiermodels van de ziekte heeft zijn eigen unieke reeks van uitdagingen. Onvolwassen dieren kunnen zo weinig als 6 g (P8 muis) wegen tot 17 g (P6 rat). Het is vrijwel onmogelijk om seriële meerdaags tethered EEG-registraties als gevolg van verhoogde belasting van tether en onvermogen leveren aan natuurlijke kweken van de pup door de dam mogelijk. Tot dieren worden gespeend, moeten ze in de zorg van de dam blijven. De dam is gevoelig voor elke geëxternaliseerd connector montage te vernietigen op de pup, de pup te beëindigen, en in sommige gevallen het hele nest te beëindigen. Bovendien is de onrijpe knaagdier schedel is het moeilijk om een electrode voetstuk bevestigen aan de schedel met mechanische integriteit. Deze uitdagingen, die uniek zijn voor onvolwassen knaagdieren, vereisen een nieuwe oplossing voor het maken van robuuste, langdurige electrografische opnames. Hier richten we ons op het aantonen van de implantatie en registratie van EEG het gebruik van een nieuw miniatuur draadloze zender en de huidige drie proof-of-principle experimenten als voorbeelden voor het gebruik van de miniatuur draadloze telemetriesysteem: 1) de imvolwassen rat pup model van hypoxie-ischemie, 2) volwassen muizen behandeld met DFP status epilepticus en daaropvolgende spontane attaques en 3) genetisch model van vasculaire caverneuze afwijkingen die leiden tot convulsies en dood in volwassen muizen te induceren.
De mini draadloze telemetriesysteem werden vier belangrijke vereisten: (1) minimaal invasieve chirurgische implantatie; (2) de compatibiliteit voor de huisvesting van knaagdieren pups met de dam en nestgenoten; (3) een laag stroomverbruik van het toestel, hetgeen aldus maanden continue bewaking zonder chirurgische re-implantatie; en (4) het vermogen om hoge kwaliteit EEG golfvormen nemen met minimale beweging artefacten. De draadloze zender weegt <0,6, 2,3 en 4 g en is <0,3, 0,8, en 1,4 cm 3, afhankelijk van de batterij met een voetafdruk van 5 x 7, 7 x 9, of 7 x 12 mm die gemakkelijk mounts aan de schedel van het dier met cyanoacrylaat gel. Geen bot pluggen zijn nodig om veilig te brengen van het apparaat naarde schedel, waardoor het aantal gaten te boren in de schedel en de operatieduur. Het apparaat kan amplificeren twee kanalen van EEG of lokale veldpotentialen diep hersenstructuren zoals de hippocampus, meer dan 2 weken, 2 maanden of 6 maanden in deze configuratie. Het kleine formaat van de draadloze zender vermindert het risico van infectie, vergroot de mobiliteit dieren en vermindert uiteindelijk morbiditeit en mortaliteit die anders verhoogt de tijd, geld, en het aantal dieren dat nodig is voor een experiment. Alle van de elektronica en de accu zijn opgepot in medische kwaliteit epoxy, dat maakt het toestel waterdicht en taai, het voorkomen van de dam van het kauwen op de zender die anders het apparaat onbruikbaar kan maken. Unlike radiofrequente zenders, het telemetriesysteem gebruikt capacitieve koppeling tussen de zender en ontvanger een antenne die ligt onder het dier kooi, zodat de gebruiker de dieren in standaard knaagdieren behuizing houden. Meerdere kanalen van recording zorgen voor de opname van multi-modale biopotentialen, zoals elektrocardiogram en elektro. Dierlijke modellen van co-morbiditeit zullen profiteren van de mogelijkheid om biopotentialen opnemen tijdens het gedrag van 21-23. De combinatie van gedrag met EEG-monitoring zal de onderzoekers een beter instrument voor onderzoek en pre-klinische studies.
Het kan erg duur om langdurige elektrografische opnamen in kleine diermodellen van de ziekte. Door te vertrouwen op eenvoudige elektrische circuits en het benadrukken van een laag stroomverbruik, zijn we in staat om een zender (figuren 1 en 2) dat de kosten van de lange-termijn monitoring experimenten vermindert creëren. De totale kosten van een 6 maanden controle experiment kon zo laag zijn als $ 470, plus de kosten van het dier (~ $ 1,5 dier per diem, $ 200 zender). Het kleine formaat van de zender maakt continue ononderbroken elektrografische opnames dierenverblijf, pre-klinische modellen van menselijke ziekten, die zeer moeilijk te verkrijgen met aangebonden of radiofrequente-gebaseerde draadloze opnamesystemen (figuur 4) zijn. Tenslotte, de schedel bevestigd aard van de zender beperkt de operatietijd en stress van het dier die anders een experiment kan compromitteren. Hier tonen we proof-of-principle experimenten uit drie diffErent experimentele modellen van epilepsie: perinatale hypoxie-ischemie 13, 27, 28 in een rattenpup (figuur 4), DFP-geïnduceerde status epilepticus (figuur 5) en toevallen bij een genetisch-geïnduceerde model van caverneuze vaatmalformaties (figuur 6).
Misschien wel de meest cruciale aspect voor het verkrijgen-artefact vrij, op lange termijn elektrografische opnames is om ongeremd toegang elektrode naar de corticale regio van belang (figuur 4-6) te controleren. Dit omvat de gemeenschappelijke referentie / aardelektrode. Bijzonder kritisch is het bevestigen van de zender naar de schedel voor epidurale EEG-toepassingen. Daarbij is het mogelijk onbedoeld bekleden het uiteinde van de elektroden cyanoacrylaat gezien de zeer korte lengte van de elektroden. Coaten van de elektroden in cyanoacrylaat kan de EEG-signalen verzwakken of volledig te isoleren ze in de worst-case scenario. Evenzo gebrek aan goede elektrische verbinding between gemeenschappelijke referentie / massa en de hersenen van het dier voorkomt goede werking van de verschilversterker in de zender, waardoor een elektrisch 'noisy "signaal. Vaak, na een operatie, goede kwaliteit signalen kunnen worden gecompromitteerd tot 48 uur vanwege oedeemvorming rond de boorgaten in de schedel. Als het oedeem afneemt, signalen over het algemeen te verbeteren. Dit kan worden vermeden door het plaatsen van de elektroden op het oppervlak van de schedel zonder boorgaten. De gevolgen van dit proces verhoogd potentieel het bekleden van de elektroden cyanoacrylaat, verminderde hoogfrequente activiteit als gevolg van de laagdoorlaat elektrische eigenschappen van het schedelbeen, en de mogelijkheid om elektrisch te isoleren van de gemeenschappelijke referentie / gemalen waardoor ruis in de signalen. Het beoefenen correcte plaatsing van de elektroden kan met een dun stuk hout of fineer dat de dikte van de muis of rat schedel nabootst. De in dit manuscript resultaten illustreren het quateit van de opnames die kan worden verkregen met behulp van draadloze telemetrie technologie.
Chirurgische implantatie toepassing van de hierin beschreven werkwijze kan zo weinig als 10 minuten, afhankelijk van de complexiteit van de operatie. Voor chirurgische toegang tot diepe hersenstructuren zoals het CA1-gebied van de hippocampus, het het beste om de zender bevestigen aan een micromanipulator gemonteerd op een stereotaxisch frame. De micromanipulator zal de chirurg voorzien van de nauwkeurigheid van de zender implanteren volgens gepubliceerde stereotaxische coördinaten in de atlas van de muis 29 en 30 ratten hersenen. Dit kan gedaan worden door simpelweg hechten een stuk injectienaald slang aan de zender cyanoacrylaat en monteren van de hypodermische naald in de micromanipulator. Micromanipulator beheersing van x, y en z coördinaten verhoogde stabiliteit bij het monteren van de zender naar de schedel vóór hechten van de huid gesloten. De toevoeging van botschroeven rond het perimeter van de zender kan helpen verankeren de zender naar de schedel, hoewel ze niet noodzakelijk. Botschroeven kan effectief zijn, maar in sommige diermodellen van aanvallen en epilepsie, zoals lithium-pilocarpine-behandelde volwassen rat. Deze dieren hebben de neiging om spontaan convulsies met intense motorische activiteit die de zender tijdens de inbeslagneming kan beschadigen hebben. Aanvullende complexiteit kan worden toegevoegd om deze experimenten. Bijvoorbeeld, de zender is compatibel met vele verschillende modellen van traumatisch hersenletsel, zoals gecontroleerde corticale invloed 31. De duurzaamheid van de zendinrichting werd getest door het implanteren van dieren zenders op P7, en vervolgens ze te huisvesten in de dieren faciliteit. Na 12 maanden meeste implantaten intact op de schedel. Bij dieren werden gedood, de schedels normaal lijkt te zijn en de zender is verankerd in het schedelbot, hetgeen aanzienlijke kracht om het uit te pakken. Wees voorzichtig bij het diepe hersenstructurenzijn onderzocht; de hersenen groeit en de elektroden stil blijven, zou de uiteindelijke positie van de elektroden worden verwacht veranderen. Voor de hier beschreven technieken werden de elektroden typisch boven de dura, waardoor zowel de hersenen en de schedel te groeien en positioneringen hun oorspronkelijke positie blijven. De beperkende factor in hoe lang de zender kan worden gebruikt, is de grootte van de batterij (dat wil zeggen tot de batterij leeg is).
Een self-contained monolithische ontwerp (de zender is ingebed in hard epoxy) van de behuizing van de zender leent zich om te gebruiken met onvolwassen pups ondergebracht bij de dam en hun nestgenoten. Vaak co-housing geïmplanteerde dieren met vast aanbinden leidt tot de vernietiging van de geïmplanteerde apparatuur of cannibalization van de pups door de dam. De gladde wanden vorm van de zender maakt voor implantatie met vrijwel geen hardware storing of verlies van pups als gevolg van kannibalisatie.
<p class = "jove_content"> De low-power-capacitief gekoppeld transmissie regeling in dit systeem leent zich goed voor het gebruik in vele verschillende experimentele scenario's, zoals plaatsing in een temperatuur-gecontroleerde incubator of zelfs voor gebruik met experimentele apparaten, zoals de plethysmografie kamers. Evenzo kan de vorm van de ontvangantenne worden gemanipuleerd om te passen in verschillende mentale omgeving, zoals de verhoogde T-maze.The bereik van de zender is slechts net naast de zender moet kunnen "drive" (capacitief koppel tot) de ontvangantenne en vertrouwt op het dier worden ondergebracht in standaard kooien knaagdieren of toepasselijke kooi onder de oppervlakte ontvanger antenne. De zender werkt als een pool van een elektrisch veld dat het lichaam van het dier optreedt als andere paal. Het veld zodat bepaalde oriëntaties, bijvoorbeeld 90 ° in fase verschoven ten opzichte van de ontvangstantenne, zullen voldoen aan de ontvangantenne waardoor besturen van een "drop out". Dit is een vrij zeldzame gebeurtenis. Toekomstige werkzaamheden met deze technologie zal het opnemen van meerdere dieren die in dezelfde kooi die aanhouding gepaard gaande kosten zal verminderen en zorgen voor sociale interactie mogelijk te maken. Verdere ontwikkelingen zal betrekken het verhogen van het aantal kanalen, waaronder de temperatuur, en elektromyogram. Het huidige ontwerp van de inrichting een bandbreedte die is geoptimaliseerd voor het hercoderen van klassieke EEG banden, die niet geschikt is voor het opnemen van snelle golven of hoogfrequente oscillaties. In de toekomst kan de inrichting worden aangepast aan de hoogfrequente componenten van het signaal op te nemen, maar ten koste van de levensduur van de batterij. Verschillende soorten omzetters omvat bloeddruk en de druk-volume, en zelfs het ontstaan van een zender elektrode-inrichting door de gebruiker gespecificeerde afmetingen volgens stereotactische coördinaten van het gewenste hersenstructuren.The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke R43 / R44 NS064661.
Sterile Surgical Gloves | Protective Industrial Products | 100-3201 PF | Power Free Sterile Latex Surgical Glove |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | |
Scalpel Blade #15 | FST | 10015-00 | |
Fine Scissors | FST | 14090-09 | |
Burr tool | Ram Products, Inc. | Microtorque II | |
Fine burr | FST | 19007-07 | |
Aneurism clip | ROBOZ | RS-5422 | |
Toothed Forceps | FST | 11022-14 | |
Cotton-Tipped applicators | McKesson | 24-103 | |
Needle Driver | WPI | 521725 | Olsen-Hegar Needle Holder |
Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 4541 | |
Cyanoacrylate accelerant | Henkel | Loctite 7452 | |
Suture | Ethicon | Vicryl RB-1 J304 | |
Elecrocautery disposable | Bovie | AA01 | Fine Tip |
Surgical Tray | FST | 20311-21 | |
Epitel Receiver Base | Epitel Inc | N/A | |
Epitel wireless transmitter | Epitel Inc | N/A | |
Biopac digitizer | Biopac | MP-150 | |
PC-compatible computer |