Выделение Миофибробласты из мышиных и человеческих пищевода
Summary
We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.
Abstract
Мышиные и человеческие пищевода миофибробласты генерируются с помощью ферментативного расщепления. Новорожденных (8-12 день назад) мышиного пищевода собирают, измельчают, промывают и подвергают ферментативным расщеплением коллагеназой и диспаза в течение 25 мин. Человека резекции пищевода образцы лишены мышечной слизистой и адвентиции и остальные слизистой оболочки измельчают и подвергают ферментативному расщеплению коллагеназой и диспазу на срок до 6 часов. Культивируемые клетки выразить α-SMA и виментин и ускоренная десмин слабо или не на всех. Условия культивирования не способствуют росту эпителиальных, кроветворной, или эндотелиальных клетках. Чистота культуры дополнительно подтверждается оценки цитометрии потока клеточной поверхности маркера экспрессии потенциального загрязняющего кроветворной и эндотелиальных клеток. Описанная методика проста и приводит к последовательной генерации без hematopoieitc, без эндотелиальных клеток стромы. Ограничения этого метода присущи использованиемпервичные культуры в молекулярных исследованиях биологии, т.е. неизбежно изменчивость встречается у культур, созданных в разных мышей и человека. Первичные культуры, однако являются более представительным отражением состояния в естественных условиях по сравнению с клеточными линиями. Эти методы также обеспечить следователям возможность выделить и культивировать стромальных клеток из различных клинических и экспериментальных условиях, что позволяет провести сравнение между группами. Характеризуется пищевода стромальные клетки могут быть также использованы в функциональных исследований следственных эпителиальные-стромальных взаимодействий в пищевода расстройств.
Introduction
Эпителиальные-стромальных взаимодействий участвуют в регуляции различных функций желудочно-кишечного тракта, включая регенерацию слизистой оболочки, ремонта, фиброз и канцерогенеза 1,2. Эти взаимодействия были наиболее изученным в тонкой и толстой кишки, и может также играть роль в слизистой расстройств пищевода 3. Субпопуляции кишечные и стромальные клетки толстой называемых миофибробластами было продемонстрировано участие в опосредовании повреждение тканей, воспаление и ремонт 4,5. В дистальной желудочно-кишечного тракта, эти клетки в форме веретена расположены рядом с базальной мембраны на границе раздела между эпителием и собственной пластинки и определяется как α-SMA и виментина положительным, пан-цитокератин отрицательным, и слабо положительной, так и отрицательной десмин 5.
Пищевода стромы не были тщательно характеризуется на клеточном или молекулярном уровне. Наша работа в мышиной пищевода была деmonstrated α-SMA и Виментин клетки в пищеводе стромы, иногда нижележащих для плоского эпителия 6. Эпителиальные-стромальных взаимодействий были вовлечены в слизистой пищевода расстройств, таких как желудочно-пищеводного опосредованной травмы 6 и эозинофильный эзофагит 3. Фиброзные стриктуры также известен осложнение пищевода травмы и стромальных клеток были вовлечены в патогенез желудочно фиброза. Выделение этих клеток поможет выполнить необходимые исследования для изучения ненормальных сигнальных путей.
Это представление предоставляет методы, необходимые для установления первичных культур α-SMA положительных, виментина положительных миофибробластов таким образом, что существующие пробелы в знаниях о сигнальных путей, опосредующих эти взаимодействия могут быть решены. Техника, описанная успешно используется авторами для создания первичных мышиных толстой миофибробласты 7 и furtheR приспособлен для создания мышиных 6 и миофибробластного, как пищевода стромальных клеток человека.
Здесь мы описываем условия, необходимые для создания и охарактеризовать этих культур, установленные с помощью мыши или человека пищевода до использования в будущих функциональных исследований. Культуры можно выращивать и использовать в течение по 15 проходов. Выделение и установление первичных культур с помощью методов, описанных ниже генерирует стромальных клеток с фенотипом миофибробластного; α-SMA, Виментин положительных и слабо положительным или отрицательным для десмина и цитокератин отрицательным. Этот фенотип отличается от фенотипа фибробластов пищевода, который в основном положительным виментин, α-SMA отрицательной 3 или α-SMA положительным, виментина отрицательного фенотипа мышечной слизистой оболочки 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы генерации первичной культуре в целом схожи при использовании мыши или тканей человека с мясорубки и пищеварения времена, адаптированных для размера ткани. Наш опыт работы с мышиной ткани предполагает, что с помощью описанных выше методов последовательно привести к успешного у?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | ||
| Tissue culture reagents | ||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 |
| dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 |
| collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 |
| sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
| FBS | Sigma) | F42442 |
| transferrin | Roche | 10-652-202-001 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| Reagents for immunostaining | ||
| goat serum | Sigma Aldrich | G9023 |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 |
| DAPI | sigma-aldrich | D8417 |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | ebiosciences | 48-0319-410 |
| CD90 conjugated to APC | ebiosciences | 17-0909-41 |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 |
| mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 |
| Equipment | ||
| 5 ml tube | eppendorf | 30108310 |
| Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope |
| Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 |
| Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope | Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan) | |
| 6 well plates | Corning | 3516 |
| T25 Flasks | TRP | 90026 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Dissection Scissors | Dissection Scissors | Dissection Scissors |
| Dissection Forceps | Dissection Forceps | Dissection Forceps |
| Single Tipped Q-Tips | Kendall | 540500 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Software | ||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | |
| FACSCAlibur | BD Bioscience | |
| FACSVerse | BD Bioscience |
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
