בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם
Summary
We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.
Abstract
myofibroblasts העכברי והוושט אנושי נוצרים באמצעות עיכול אנזימטי. ילוד הוושט עכברי (ישן 8-12 יום) שנקטפו, טחון, שטף, ונתונים לעיכול אנזימטי עם collagenase וdispase במשך 25 דקות. דגימות כריתת הוושט אדם ניטלו ממנו propria muscularis וadventitia והרירית הנותרת טחונות, ונתונים לעיכול אנזימטי עם collagenase וdispase עד 6 שעות. תאים בתרבית להביע α-SMA וvimentin וdesmin המפורש חלש או בכלל לא. תנאי תרבות הם לא תורמים לצמיחה של אפיתל, דם, או תאי האנדותל. טוהר תרבות הוא אישר עוד יותר על ידי הערכת cytometric זרימה של ביטוי סמן תא שטח של hematopoietic המזהם הפוטנציאלי ותאי האנדותל. הטכניקה המתוארת היא פשוטה ותוצאות בדור של אי-hematopoieitc, תאי סטרומה שאינם עולה בקנה אחד אנדותל. מגבלות של שיטה זו הן אינהרנטי לשימוש בתרבויות עיקריות בלימודי ביולוגיה מולקולריים, כלומר, השתנות בלתי נמנעות נתקלו בין תרבויות הוקמו על פני עכברים או בני אדם שונים. תרבויות עיקריות עם זאת הן השתקפות נציג יותר של מדינת in vivo בהשוואה לשורות תאים. שיטות אלה מספקים גם חוקרים היכולת לבודד ותאי סטרומה התרבות ממצבים קליניים וניסויים שונים, המאפשר השוואה בין קבוצות. גם תאי סטרומה הוושט מאופיינים ניתן להשתמש במחקרים תפקודיים חוקרים אינטראקציות אפיתל-סטרומה בהפרעות בושט.
Introduction
אינטראקציות אפיתל-סטרומה מעורבות ברגולציה של מגוון רחב של פונקציות במערכת עיכול כוללים התחדשות רירית, תיקון, סיסטיק, והיווצרות סרטן 1,2. אינטראקציות אלה נחקרו הטובים ביותר במעי הדק ובמעי הגס ועלולות דומה משחקות תפקיד בהפרעות ברירית הוושט 3. תת-אוכלוסייה של myofibroblasts תאי סטרומה מעי הגס וכינה הודגמה להשתתף בתיווך פגיעה ברקמות, דלקת ולתקן 4,5. במערכת עיכול דיסטלי, תאי ציר בצורה הבאות נמצאים בסמוך לקרום במרתף בממשק שבין propria האפיתל וlamina ומוגדרים כα-SMA וvimentin חיובי, פאן-cytokeratin השלילי, וחולשה חיובית או שלילי desmin 5.
סטרומה הוושט לא התאפיינה בקפדנות ברמה תאית או מולקולרית. העבודה שלנו בוושט העכברי עוברת דהα-SMA monstrated תאים וvimentin בסטרומה הוושט, לעתים subjacent לאפיתל קשקש 6. אינטראקציות אפיתל-סטרומה היו מעורבות בהפרעות ברירית הוושט כגון פגיעת גסטרו-הוושט תיווך 6 ושט אאוזינופילית 3. הגבלות fibrotic גם סיבוך ידוע של תאי פציעה וסטרומה הוושט היה מעורבת בפתוגנזה של סיסטיק עיכול. בידוד של תאים אלה יסייע להשיג את המחקרים הדרושים כדי לחקור מסלולי איתות מופרעים.
הגשה זו מספקת את הטכניקות הדרושות כדי להקים תרבויות עיקריות של myofibroblasts α-SMA החיובי, vimentin החיובי כך פערים קיימים בידע לגבי מסלולי איתות תיווך אינטראקציות אלה ניתן לטפל. הטכניקה המתוארת שמשה בהצלחה על ידי מהחברים להקים myofibroblasts העיקרי עכברי המעי הגס 7 וfurther מותאם להקמת עכברית 6 ותאי סטרומה אדם כמו myofibroblast-הוושט.
במסמך זה אנו מתארים תנאים הנדרשים כדי להקים ולאפיין תרבויות אלה הוקמו מעכבר או וושט אדם לפני השימוש במחקרים תפקודיים עתיד. ניתן לגדל תרבויות ומנוצלות עד ליום 15 במעברים. בידוד והקמת התרבויות העיקריות באמצעות השיטות מפורטות להלן מייצר תאי סטרומה עם פנוטיפ myofibroblast; α-SMA, vimentin חיובי, וחולשה חיובי או שלילי לdesmin, וcytokeratin שלילי. פנוטיפ זו שונה מהפנוטיפ של פיברובלסטים הוושט שהיא בעיקר vimentin חיובי, α-SMA השלילי 3 או הפנוטיפ השלילי החיובי, vimentin α-SMA של muscularis mucosae 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקות לדור התרבות העיקרית הן בדרך כלל דומות בעת שימוש ברקמה עכברית או אדם עם זמנים וגנדרניים ועיכול מותאם לגודל רקמה. הניסיון שלנו עם רקמה עכברית מצביע על כך ששימוש בשיטות שתוארו לעיל לגרום באופן עקבי בהקמה מוצלחת של תרבויות עיקריות. צעדים קריטיים בפרוטוקול כולל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | ||
| Tissue culture reagents | ||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 |
| dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 |
| collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 |
| sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
| FBS | Sigma) | F42442 |
| transferrin | Roche | 10-652-202-001 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| Reagents for immunostaining | ||
| goat serum | Sigma Aldrich | G9023 |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 |
| DAPI | sigma-aldrich | D8417 |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | ebiosciences | 48-0319-410 |
| CD90 conjugated to APC | ebiosciences | 17-0909-41 |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 |
| mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 |
| Equipment | ||
| 5 ml tube | eppendorf | 30108310 |
| Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope |
| Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 |
| Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope | Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan) | |
| 6 well plates | Corning | 3516 |
| T25 Flasks | TRP | 90026 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Dissection Scissors | Dissection Scissors | Dissection Scissors |
| Dissection Forceps | Dissection Forceps | Dissection Forceps |
| Single Tipped Q-Tips | Kendall | 540500 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Software | ||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | |
| FACSCAlibur | BD Bioscience | |
| FACSVerse | BD Bioscience |
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
